Методика проведения вегетационных опытов с Р32
Метод меченых атомов позволяет работать с «мечеными удобрениями» и проследить поступление в растения питательных веществ из удобрений и их превращения в растении и в почве. Применение радиоактивного изотопа фосфора дало возможность получить новые данные о фосфорном питании растений, проверить правильность многих ранее высказанных положений и разработать новые представления о фосфорном обмене у растений.
Использование метода радиоактивных индикаторов основано на добавлении к нерадиоактивному изотопу ничтожно малого количества радиоактивного изотопа этого элемента. В результате этого добавления происходит изменение изотопного состава элемента, и так как изотопы практически одинаковы по химическим свойствам, то по радиоактивной добавке можно судить о содержании данного элемента. Добавка радиоактивного изотопа является радиоактивным индикатором, по которому можно проследить распределение, передвижение и накопление в растении меченого им элемента.
В радиоактивных препаратах фосфора, с которыми приходится иметь дело при постановке вегетационных опытов, содержание P32 ничтожно мало. Например, когда 1 г P2O5 имеет активность в 0,1 мккюри, в нем содержится только 1,5*10в-7 мг P32, все остальное количество фосфора этого препарата является нерадиоактивным фосфором P31. Таким образом, удельная активность ничтожных количеств радиоактивных индикаторов весьма высока, что позволяет обнаруживать при помощи их количество вещества порядка 10в-14 г.
Набивка вегетационных сосудов. При проведении вегетационных опытов с радиоактивными изотопами необходимо соблюдать определенные правила предосторожности, чтобы не причинить вреда здоровью работающих.
Опыты с радиоактивным изотопом фосфора P32 при соблюдении элементарных правил предосторожности не могут привести к нежелательным в отношении здоровья явлениям. Радиоактивный изотоп Р32 имеет сравнительно короткий период полураспада, он нелетуч, применяется в относительно небольших дозах, хорошо абсорбируется почвой, т. с. обладает свойствами, которые делают его относительно безопасным элементом.
Работа с получаемыми для опытов концентрированными препаратами, имеющими высокую удельную активность, должна проводиться в специальной лаборатории, которая удовлетворяет санитарным правилам работы с радиоактивными веществами. Все операции: вскрытие ампул, разведение и приготовление рабочих растворов или активных удобрений, проводятся в вытяжном шкафу на кювете во избежание возможного разлива радиоактивного раствора. Все работающие должны быть в халатах и резиновых перчатках.
Препараты с высокой активностью следует хранить в специальном хранилище, в металлическом сейфе. По получении исходных концентрированных препаратов необходимо возможно скорее перевести их в те рабочие растворы и препараты удобрений, которые будут применяться в опытах. Радиоактивное излучение препаратов в окружающую среду зависит от самопоглощения радиоактивных веществ, т. е. от поглощения излучений в толще самого препарата. При разведении препаратов происходит увеличение самопоглощения; в результате этого излучение, испускаемое препаратами во внешнюю среду, сокращается во много раз. Например, получен препарат фосфата калия с удельной активностью 1 мкюри в 1 мл раствора. Если для постановки опытов требуется вносить по 100 мккюри на сосуд, то легко и точно измеряемым количеством раствора будет 10 мл раствора на сосуд. Следовательно, полученный препарат надо развести в 100 раз до удельной активности в 10 мккюри на 1 мл раствора или до 100 мккюри на 10 мл. Самопоглощение излучения в разбавленном растворе будет большое, так как большинству р-частиц надо будет проходить сквозь слой жидкости. Аналогичное увеличение самопоглощения будет происходить и при внесении радиоактивных удобрений. Внося 100 мккюри на один сосуд, в который помещается не менее 1 кг почвы, мы производим дальнейшее увеличение самопоглощения; удельная активность вещества равна теперь только 0,1 мккюри на 1 кг почвы. Излучение поглощается теперь большим количеством почвы, стенками сосуда, слоем песка, насыпанным сверху, и уже не может иметь существенного влияния на развитие растений. Таким образом, первым правилом работы с радиоактивными изотопами является возможно более быстрое разбавление их веществом, в котором происходит большое самопоглощение излучения.
Измерение необходимых количеств растворов радиоактивных веществ должно производиться автоматическими пипетками или бюретками. При набивке сосудов обычно радиоактивный изотоп фосфора добавляется к раствору немеченого фосфора, чтобы его «пометить».
При набивке сосудов почву высыпают в большую фарфоровую чашку и в середину почвы выливают раствор, содержащий меченый фосфат. После этого почву перемешивают с раствором руками в резиновых перчатках. При внесении больших количеств радиоактивного изотопа, например в опытах по установлению токсических для растений доз, раствор предварительно размешивают с почвой стеклянной или фарфоровой палочкой, а затем уже руками в перчатках.
Сначала производится набивка сосудов, в которые не вносится радиоактивный изотоп, затем набивка сосудов с возрастающими дозами P32. При такой последовательности необязательно тщательно отмывать чашку, переходя к набивке следующего сосуда, а достаточно ее протереть сначала небольшим количеством неудобренной почвы и песка, а затем марлей. Необходимо следить за тем, чтобы поверхность чашек была гладкая, а не шероховатая.
Дозы 15Р32. Существенное значение при проведении вегетационных опытов имеет установление правильной дозы радиоактивного изотопа, обеспечивающей и точность аналитической работы, и отсутствие токсичности радиоактивного вещества для растений.
Чтобы получить достоверные результаты определения активности урожая при серийных, массовых анализах, должна быть обеспечена возможность непосредственного определения активности излучения в навеске сухого вещества в 0,1-0,2 г. При этом количество импульсов для этой навески, за вычетом «фона» (т. е. числа импульсов, получающихся от такой же навески сухого нерадиоактивного вещества), должно быть не менее как в 2—3 раза больше, чем число импульсов для фона. Наличие в конце опыта небольших отсчетов, близких по величине к фону, приводит к неточным определениям, не допускающим количественных вычислений выноса фосфора урожаем.
В Научном институте удобрений инсектофунгицидов и Почвенном институте им. В.В. Докучаева было проведено большое количество вегетационных опытов по установлению оптимальной дозы P32. Установлено, что при скорости распада радиоактивного изотопа фосфора (период полураспада Р32 — 14,2 дня) возможно проведение краткосрочных вегетационных опытов с малыми дозами P32, порядка 5—10 мккюри на сосуд. Ho в вегетационных опытах, в которых растения доводятся до полного созревания, к концу опыта P32 распадается на 90—95%.
Было показано, что в почвенных культурах внесение дозы порядка 100—200 мккюри на сосуд обеспечивает достоверные отсчеты в конце опыта при отсутствии токсического действия радиоактивности на растения.
Отношение растений к дозам P32 различно. По выносливости к высоким дозам P32 растения располагаются в следующий ряд, начиная с менее выносливых: гречиха, зерновые злаки, горох, лен, горчица. Токсичность P32 в опытах с зерновыми злаками была заметна при дозе в 500 мккюри на 1 кг почвы, в опыте с гречихой — при дозе в 360 мккюри, в опыте с горохом — при дозе в 1000 мккюри. Для льна и горчицы не было отмечено вредного действия P32 и при этой высокой дозе. Следует иметь в виду, что эти данные относятся к равномерному и тщательному перемешиванию радиоактивного удобрения с 1-килограммовой навеской почвы. В опытах с местным внесением следует брать меньшие дозы P32. Вообще желательно работать с возможно более низкими дозами P32. Нужно учитывать, что токсичность P32 зависит от типа почвы; чем сильнее фиксирует почва фосфаты, тем более высокие дозы легко переносят растения. Так, на черноземе токсичность высоких доз P32 больше, чем на подзолистом суглинке. Таким образом, при установлении дозировки P32 для конкретного опыта следует учесть его длительность, способ внесения фосфата, особенности растения и особенности почв. Внесение фосфорных нерадиоактивных удобрений уменьшает токсичность P32.
Размол урожая. Определение активности полученного в опыте урожая производится в навеске сухого вещества. Размол вещества производится на мельнице типа «Пируэтт».
Весьма важно, чтобы размол проводился в определенной последовательности. Сначала нужно размалывать материалы без радиоактивных веществ, а затем — в порядке возрастания их активности. При таком порядке размола меньше опасность засорения урожаев радиоактивными веществами. В противном случае приходится перед размолом каждого нового образца производить тщательную чистку мельницы и длительный размол нерадиоактивного вещества. При размоле урожаев первые порции размола отбрасываются.
Работающие должны иметь очки-консервы и закрывать нижнюю часть лица марлевой повязкой или надевать респиратор во избежание попадания пыли в глаза и носоглотку. Размол и просев радиоактивной массы следует производить под тягой. Для очистки помещения от пыли радиоактивных веществ надо протирать стены и мебель или удалять пыль пылесосом. Все работающие должны быть в халатах или комбинезонах.
Определение активности урожаев. Точность определения активности зависит от строгого соблюдения во всех случаях однородности условий определения. С этой целью необходимо иметь всегда одинаковые навески однородного по своим качествам вещества (солома, зерно и т. д.) и одинаковую тару. В качестве тары при определении активности сухого вещества и растворов цилиндрическим счетчиком в горизонтальном домике, как показала практика, удобны фарфоровые лодочки, употребляемые для сжигания органического вещества, или аналогичная тара с гладкими блестящими, легко очищаемыми стенками. При объеме раствора 1—2 мл и величине навески сухого вещества растений 0,1-0,2 г удобны лодочки длиной 5—8 см и шириной около 1,0 см. Если измерения проводятся торцовым счетчиком, то для подсчета активности растительной массы и растворов хорошо себя зарекомендовали стеклянные чашечки диаметром 25—30 мм, высотой 10—12 мм. Все чашечки должны иметь плоское дно и одинаковый диаметр. Такие чашечки легко приготовляет стеклодув из стеклянных трубок одного диаметра. Навеска сухой массы в стеклянную чашечку берется 0,2 г, раствора — 2 мл.
При работе с небольшими объемами растворов лодочки необходимо мыть эфиром, чтобы обеспечить равномерное растекание жидкости по их дну. Очистка чашечек и лодочек от радиоактивного вещества производится промывкой раствором 10 %-ной соляной кислоты, иногда их приходится прокипятить с кислотой. После обработки соляной кислотой лодочки промывают под струей воды. Этими приемами достигается очистка посуды от загрязнений радиоактивным фосфором. Перед взятием пробы тару проверяют на счетчике на остаточную активность. При низкой активности урожаев необходимо иметь совершенно чистую тару. Если производятся определения активности образцов, дающих около 1000 имп/мин, остаточная активность лодочек порядка 3—5 имп/мин не имеет существенного значения.
При определениях небольших активностей следует обращать особое внимание на правильное установление фона. Фон должен устанавливаться до начала определений и после их окончания. Для точного определения фона помещают под счетную трубку лодочку с навеской нерадиоактивного вещества: зерна, соломы, раствора, в зависимости от того, активность какого вещества далее будет определяться.
Расположение лодочки или чашечки под счетчиком должно быть точно зафиксировано как в вертикальном, так и в горизонтальном направлении. Расстояние лодочки от счетной трубки при массовых определениях активности сухого вещества не должно быть очень малым, так как в этом случае малейшее изменение расстояния от счетчика, вследствие неравномерности поверхности вещества или его уплотнения, скажется на точности определений. Практически удобно расстояние порядка 2—4 см. Чашечка фиксируется на пластмассовой подставке, прилагаемой к вертикальному свинцовому домику для счетчиков.
Поправка на самопоглощение. При вегетационных опытах определяют активность урожаев в навеске сухого вещества 0,1-0,2 г. Такое количество вещества легко разместить равномерно на дне лодочки или чашечки, площадь которых примерно одинакова. Самопоглощение излучений веществом будет небольшим вследствие тонкого слоя вещества. Самопоглощение зависит от количества вещества на 1 см2 поверхности, в данном случае оно составит около 12—25 мг/см2, что, по имеющимся данным, почти не влияет на количество отсчетов.
Активность исходных удобрений можно определять в растворах. Минимальное количество их, которое может быть равномерно распределено по дну тары, около 1—2 мл. При точных определениях следует измерение объемов заменить взвешиванием лодочки с раствором на аналитических весах.
При объеме раствора 1 или 2 мл его самопоглощение достигает уже заметных величин, так как на 1 см2 приходится уже 125—250 мг. Поэтому необходимо установить коэффициент пересчета с 1 или 2 мл раствора на 0,1 или
0,2 г сухой массы для внесения поправки на самопоглощение. Этот коэффициент приходится устанавливать эмпирически, производя разведение небольших количеств раствора или выпаривание 1 или 2 мл раствора. Более точно этот коэффициент устанавливают при сопоставлении активности навески 0,2 г сухого вещества и активности раствора зольных веществ этой навески объемом 2 мл. Повторив определение несколько раз, получают коэффициент, позволяющий переводить количество импульсов, найденное в урожае, на количество импульсов в растворе исходного удобрения.
Выражение результатов опытов в миллиграммах меченых фосфатов. Число распадающихся атомов прямо пропорционально числу атомов радиоактивного вещества, т. е. в определенное время всегда распадается определенная часть всех атомов. Например, для радиоактивного фосфора P32 всегда за 14,2 дня распадается половина всех атомов этого изотопа, за 28,4 дня распадается 3/4 всех атомов и т. д. Скорость распада атомов зависит только от особенностей строения атомов радиоактивного изотопа и не зависит от химических реакций и внешних условий (температуры, давления и т. д.), в которых находится вещество. Поэтому, зная число распадов в навеске вещества для одной календарной даты, можно точно сказать, сколько распадов атомов будет происходить в этой навеске в любой другой день. В табл. 6 приведены коэффициенты, которые позволяют вычислить количество импульсов радиоактивного фосфора на любой день опыта. В табл. 7 приведены коэффициенты для радиоактивного кальция.
Чтобы избежать ослабления активности урожая, определения надо производить вскоре после снятия урожая.
Результаты исследований в ряде случаев можно выражать числом импульсов в 1 мин. на 1 г вещества. Ho в большинстве вегетационных опытов необходимо определить вынос меченого фосфора в миллиграммах P2O5 в урожае или в 1 г сухого вещества. Для такого расчета необходимо знать удельную активность внесенного меченого удобрения, т. е. какое количество импульсов при данных условиях определения соответствует 1 мг P2O5 меченого фосфора. Это может быть сделано двумя способами.
При первом способе после соответствующего разведения исходного раствора определяют количество импульсов, приходящееся на 2 мл раствора. Далее вычисляют, сколько импульсов приходится на 1 мг P2O5 в исходном растворе. Так как определение активности урожаев производится в сухом веществе, то вводится поправочный коэффициент на более сильное самопоглощение излучений при работе с 2 мл раствора, чем при 0,2 г сухого вещества. В зависимости от условий определения этот коэффициент может быть различным. О способах его определения сказано ранее. Неудобство этого способа — введение коэффициента пересчета с раствора на сухое вещество урожая, которое может быть взято в разных навесках и, может занимать различный объем, т. е. иметь различное самопоглощение излучения.
Можно использовать и другой прием определения удельной активности удобрения. Одновременно с взятием навесок опытных растений берут несколько навесок «чистой» массы растения, выращенного на той же почве без внесения метки P32, и смачивают в чашечках небольшим, точно измеренным объемом раствора «свидетеля», т. е. меченого раствора, который вносился в почву при набивке опыта. Смоченная навеска высушивается в термостате, масса тщательно перемешивается и уплотняется, как все остальные навески опытных растений.
Определив радиоактивность навески и зная объем раствора, отмеренный в чашечку, и объем раствора, внесенного в сосуд, можно вычислить общее число импульсов, характеризующее радиоактивность фосфатов, поступивших на сосуд, и рассчитать удельную активность вносимого раствора в импульсах на 1 мг носителя P2O5 (при одинаковых условиях определения).
Второй способ представляется несколько более сложным, но он позволяет не пользоваться пересчетными коэффициентами. Допустим, что ставится вегетационный опыт в почвенных культурах, при котором вносится меченый фосфат. В урожай поступает в этом случае как меченый фосфор из удобрений, так и немеченый фосфор. Если поставить контрольный опыт в песчаных культурах, в которых в одних сосудах внесен только меченый фосфат, а в других совсем не внесено фосфора, то можно определить удельную активность меченого фосфата. По выносу фосфора растениями, выросшими на песке без внесения фосфора, судят о поступлении фосфора из семян. На эту величину следует уменьшить все данные о содержании фосфора в растениях, чтобы определить поступление из внешней среды. Разделив суммарное число импульсов в урожае (по определению в навесках сухой массы) на вынос фосфора удобрений, внесенных в песчаной культуре, вычисляют удельную активность 1 мг P2O5, т. е. количество импульсов на 1 мг поступившего в растения меченого фосфора. Разделив количество импульсов, приходящееся на урожай, на удельную активность, устанавливают поступление меченого фосфора в миллиграммах P2O5. Этот способ позволяет избежать всех пересчетных коэффициентов, кроме, конечно, пересчета на время опыта по табл. 5.
Для сокращения пересчетов удобнее определять удельную активность внесенного раствора фосфата после уборки урожая, одновременно с определением радиоактивности растений. Все данные об активности растений и раствора удобрений вычисляются на один день в конце опыта.
