Биохимия фиксации азота (часть 1)
При промышленном производстве азотных удобрений осуществляется каталитическое восстановление молекулярного азота атмосферы до аммония водородом (происходящим из природного газа) в процессе Габера—Боша:
N2 + 3Н2 → 2NH3.
Для эффективного протекания реакции необходимы высокое давление и довольно высокая температура. Каким же образом эта реакция, требующая для своего протекания экстремальных условий, осуществляется в живых клетках, растущих при низких температурах и атмосферном давлении?
Биологическая фиксация азота приблизительно вдвое эффективнее процесса Габера—Боша, но тем не менее для обеспечения энергии активации при восстановлении N2 требуется 355 кДж энергии на моль образуемого NHj. Нитрогеназная ферментная система, катализирующая процесс восстановления, обнаружена только у азотфиксирующих организмов, и катализируемую реакцию можно представить как восстановление молекулярного азота до аммония, в котором участвуют шесть электронов:
N2 + 6Н+ + 6е- → 2NH3.
Нитрогеназа способна восстанавливать и много других молекул, сходных с молекулярным азотом наличием тройной связи, и требования к восстановлению этих соединений те же, что и к восстановлению молекулярного азота. Ниже приведено несколько примеров.
1. Двуэлектронные процессы восстановления
а) ацетилен → этилен: C2H2 + 2Н+ + 2е- → C2H4;
б) протоны → водород: 2Н+ + 2е- → Н2;
в) азид → азот и аммоний: Nf + 4Н+ + 2е- → N2 + NH4+.
2. Шестиэлектронные процессы восстановления
цианид → метан и аммоний: CN- + 8Н+ + 6е- → CH4 + NH4+.
Способное» нитрогеназы восстанавливать ацетилен имеет чрезвычайно важное практическое значение, поскольку продукт восстановления этилен можно легко обнаружить методом газовой хроматографии, чувствительность которого, как известно, очень высока. На основе этого свойства фермента был разработан ацетиленовый метод определения интенсивности фиксации азота. Это - количественный метод, поскольку уровни восстановления ацетилена и фиксации азота связаны прямой зависимостью. Дальнейшее совершенствование метода позволит быстро и надежно измерять азотфиксирующую способность клеток. Для биологической фиксации азота клетке необходимы:
1) активная нитрогеназа;
2) Mg2+ и постоянное снабжение АТФ;
3) сильный восстановитель, т.е. подходящий источник электронов;
4) низкое парциальное давление кислорода.
Нитрогеназа. Фермент, выделенный из нескольких различных источников, обнаруживает весьма сходные свойства и всегда состоит из двух чувствительных к кислороду белков, содержащих негеминовое железо. Во избежание инактивации фермента при очистке следует предотвращать его контакт с кислородом. Поскольку нитрогеназа обладает высокой чувствительностью к кислороду, для ее очистки используют метод анаэробной хроматографии. Фермент можно разделить на два различных белка коричневого цвета (из-за присутствия железа), ни один из которых не осуществляет фиксацию азота в отсутствие другого. Один из них, с более высокой молекулярной массой, представляет собой Mo-Fe-белок. Он состоит из четырех субъединиц различного типа и содержит, помимо железа, молибден, в то время как белок с меньшей молекулярной массой содержит только железо и состоит из двух идентичных субъединиц. Некоторые свойства фермента, выделенного из клеток Klebsiella pneumoniae, представлены в таблице 1.3.
Атомы железа обычно сопровождаются таким же числом соединенных с ними атомов серы. Белок с меньшей молекулярной массой особенно подвержен инактивации кислородом. Первым стабильным продуктом фиксации является аммоний, и, хотя до сих пор не обнаружены какие-либо иные свободные промежуточные продукты восстановления, например диимид (N2H2) или гидразин (N2H4), удалось показать существование промежуточного комплекса молекулярного азота с ферментом, присутствующего только в процессе ферментативного восстановления азота.
Потребность в АТФ. В процессе фиксации азота АТФ, а точнее говоря, мономагниевая соль АТФ, гидролизуется до мономагниевой соли АДФ и неорганического фосфата. Восстановление нитрогеназой всех других субстратов также сопряжено с гидролизом АТФ. Расчеты числа молекул АТФ, используемых клеткой для биологического восстановления азота, осложнены тем, что потребление и гидролиз АТФ характерны для многих других процессов, происходящих в клетке. Однако, по данным опытов in vitro, для восстановления одного моля азота до аммония необходимо 12-15 молей АТФ, т.е. 4-5 молей АТФ на пару электронов, перенесенную в процессе восстановления от восстановителя на азот. АТФ, необходимый для фиксации азота, — процесса, требующего больших затрат энергии, — может поступать из различных источников, например:
1) окисление дыхательных субстратов (у аэробных организмов);
2) фосфорокластическое расщепление пирувата до ацетата у анаэробного Clostridium, поскольку эта реакция не нуждается в экзогенном окислителе:
Пируват Кофермент А → Тиаминпирофосфат ферредоксин → АцетилКоА + Восст. ферредоксин + CO2
3) фотофосфорилирование у фотосинтетических систем.
