Биохимия фиксации азота (часть 2)
Источник восстановителя. Ферредоксины и флаводоксины — это специализированные белки с небольшой молекулярной массой (от 6000 до 24000), существующие в окисленной и восстановленной формах, которые легко взаимопревращаются. Восстановленные формы этих белков - сильные восстановители, которые в присутствии соответствующего фермента способны к восстановлению многих других биологических молекул.
Ферредоксины участвуют в целом ряде биологических процессов, включая фотосинтез (у высших растений) и обмен пирувата (у анаэробных бактерий). У Clostridium фоcфорокластическое расщепление пирувата, по-видимому, служит обычным механизмом генерации восстановленного ферредоксина, который действительно реагирует с нитрогеназой и обеспечивает восстановление азота, однако такое фосфорокластическое расщепление не универсально, поэтому следует изучать другие механизмы генерация восстановителя. Так, у аэроба Azotobacter chroococcum ферредоксин присутствует, однако основным восстановителем для нитрогеназы является флаводоксин (азотофлявин).
Флаводоксины - это белки с флавидовой (простетической) группой, желтые в полностью окисленном состоянии, бесцветные — в полностью восстановленном и голубые — в полувосстановленном, т.е. в состоянии семихинота. Флаводоксины не содержат железа, и их центр окисления-восстановления - это молекула флавина (рис. 1.2). Форма семихинона необычно устойчива к окислению кислородом воздуха и поэтому, вероятно, более пригодна для такого аэробного микроорганизма, как Azotohacter, чем ферредоксин.
Генерация электронов in vivo для процесса восстановления все еще недостаточно исследована. Ферредоксин может быть восстановлен НАДФН путем обращения реакции, катализируемой НАДФ ферредоксинредуктазой, поэтому при образовании в клетке НАДФН он может косвенно служить донором электронов для фиксации азота. У Azotobacter vinelandii, нефотосинтезирующей аэробной бактерии, НАДФН, по-видимому образуется за счет изоцитратдегидрогеназной активности:
Изоцитрат + НАДФ+ ↔ 2-Оксоглутарат + CO2 + НАДФН + Н+.
Затем электроны для процесса восстановления через специфичный ферредоксин азотобактера переносятся к азотофлаводоксину, который у этой бактерии служит промежуточным донором электронов для нитрогеназы:
НАДФ → Ферредоксин → Азотофлавин → Fе-белок (Нитрогеназа) → Mo — Fе-белок (Нитрогеназа) → N2.
Есть данные о присутствии в бактероидах корневых клубеньков бобовых растений НАДФ+ - специфичной изоцитратдегидрогеназы. Эти сведения особенно важны, если НАДФН служит донором электронов для нитрогеназы. Совпадение по времени высокой активности изоцитратдегидрогеназы в бактероидах клубеньков гороха с пиком фиксации азота у целого растения - еще одно основание предполагать, что изоцитратдегидрогеназа может поставлять НАДФН для процесса фиксации.
Ограничение доступа кислорода. Фермент нитрогеназа необратимо разрушается при контакте с кислородом, и поэтому микроорганизмы фиксирующие азот на планете, атмосфера которой содержит 20% кисло рода, нашли различные способы исключить его из зоны фиксации азота Такая адаптация не понадобилась лишь облигатным анаэробам, которые радикально решили эту проблему.
Факультативные азотфиксирующие бактерии обычно фиксируют азот только при росте в анаэробных условиях или условиях ограниченного доступа кислорода, когда кислород потребляется по мере поступления. Аэробным азотфиксирующим бактериям для поддержания высокой скорости дыхания и обеспечения синтеза АТФ необходимо соответствующее снабжение кислородом. Предполагают, что у Azotobacter высокая скорость дыхания препятствует поступлению кислорода в центры азотфиксации, поскольку способствует перехватыванию кислорода и снижению его концентрации, что позволяет функционировать нитратредуктазе. Другая гипотеза заключается в том, что конформационная защита нитрогеназы обеспечивается ее ассоциаций с другими белками, которая обусловливает снижение ее чувствительности к кислороду. Свободноживущие цианобактерии фиксируют азот в гетероцистах — специализированных клетках, расположенных вдоль нитей через определенные интервалы. Стенка гетероцисты препятствует проникновению кислорода в клетку, поэтому фиксация азота ограничена обычно гетероцистами и не происходит в вегетативных клетках нити.
Для регуляции концентрации кислорода в зоне фиксации азота в симбиотической азотфиксирующей ассоциации корневых клубеньков возникла особенно сложная система, использующая особую форму гемоглобина - леггемоглобин, образуемый растением-хозяином. Поскольку леггемоглобин обладает очень высоким сродством к кислороду, Rhizobium получают его в концентрации, безопасной для их нитрогеназы, в результате чего предотвращается накопление кислорода в высоких концентрациях и осуществляется обеспечение кислородом дыхательного метаболизма бактерий. Поэтому корневой клубенек можно рассматривать как высокоспециализированный компартмент, создающий среду, в которой фиксация азота и окислительный обмен физиологически совместимы.
