Формы и функции молибдена в растениях
Д. Арнон и П. Стоут открыли необходимость молибдена для высших растений, изучая рост томата в гидропонике. В растениях молибден находится главным образом в виде аниона MoO4в2-. Как компонент в составе ферментов может быть и в таких степенях окисленности, как Mo(IV) и Mo(VI). Основные биохимические функции молибдена связаны с его способностью изменять валентность и участвовать в реакциях комплексообразования.
Известно более SO ферментов, содержащих молибден, большей частью они находятся в бактериях. В растениях обнаружено только несколько ферментов, содержащих молибден в качестве кофактора: нитратредуктаза, нитрогена за, ксантиноксидаза/дегидрогеназа, альдегидоксидаза к, возможно, сульфатредуктаза. В этих энзимах молибден выполняет каталитическую и структурную функции.
Молибдокофакторы. У всех организмов молибден связан в комплекс с птерином (рис. 2.13), при этом формируются так называемые молибдокофакторы (Мосо). Свободные ионы молибдена каталитически неактивны. У нитратредуктазы и других Мо-ферментов (кроме нитрогеназы) Moco идентичны. В координации Mo(VI) участвует птериновое кольцо, т. е. 6-замещенный птерин с четырехуглеродной боковой цепью, содержащей дитиольную, гидроксильную и фосфатную группы.
В клетке выделяют три фракции Мосо:
1) свободная, или элементарная форма;
2) связанная с белковым фрагментом фермента;
3) связанная с белком фермента.
Элементарный Moco активен в препаратах, не прошедших кислотную и термическую обработку в присутствии протекторов и избытка молибдата. В свежевыделенных препаратах ксантиноксидазы содержание элементарного Moco не превышает 2-3%, в то время как после трех-четырех суток хранения оно может увеличиваться в 10-20 раз.
В ферментах основная функция Moco — каталитическая. Элементарному молибдокофактору присуща собственная нитратредуктазная активность. Кроме того, Moeo выполняет структурную функцию, объединяя субъединицы фермента в олигомерный комплекс. Структурная роль Moco проявляется независимо от выполнения им каталитических функций. Вероятно, функциональные группы кофактора, участвующие в самосборке фермента, отличаются от групп, обладающих каталитической активностью. Связь элементарного Moco с белком ферментов осуществляется через аминокислотные остатки. Поэтому при отделении кофактора от белка в препаратах Moco обнаруживается пептидный компонент, который включает аспарагиновую кислоту, серин, глутаминовую кислоту, глицерин, аланин, валин и др.
В олигомерном комплексе Mo-ферментов Moco связан с определенным белковым фрагментом, молекулярная масса которого существенно меньше массы всего фермента. Эту фракцию Moco рассматривают как элементарную белоксодержащую ячейку Mo-фермента, которая стабильнее нативного фермента или свободного кофактора. Мосо, связанный с белковым фрагментом, также обладает каталитической активностью, например нитратредуктазной, которая выше, чем у элементарного кофактора, но ниже, чем у нативного фермента.
С молекулой белка фермента Moco связан нековалентно. Эти связи гидрофобные и чувствительные к кислороду, они разрушаются при сравнительно слабых внешних воздействиях. Поэтому Mo-фермент может быть относительно легко разрушен, что в первую очередь сопровождается диссоциацией молибдена. Присоединение Moco к белку также происходит довольно легко. По-видимому, непрочность связи молибдокофактора с белком фермента закреплена эволюционно и обусловлена участием Moco в работе нескольких ферментов. Правда, у разных ферментов прочность связи Moco с апобелком варьирует. С белком ксантиноксидазы молибдокофактор связан прочнее, чем с белком нитратредуктазы. Поданным рентгенокристаллографических исследований молибдоптерин локализован в глубине белка Мо-ферментов, устойчив к окислению и сохраняет активность даже после инактивации фермента. Высвобождение Moco из молекулы фермента сопровождается потерей атома молибдена и утратой функций кофактора в результате окисления. В целом птериновая структура Moco уникальна, она играет важную роль в поддержании необходимых окислительно-восстановительных состояний молибдена в ферментах.
Молибдокофактор нитрогеназы (FeMoco) имеет ряд своих особенностей. Это нерастворимое в воде вещество коричневого цвета, содержащее кроме молибдена семь атомов негемового железа и девять атомов серы, со следующими степенями окисления металлов в покоящемся состоянии [Mo4- 6FeJ+ Fe3+ 9S2-]+. Молибдокофактор нитрогеназы выполняет каталитическую и структурную функции. Каталитическая функция подробно описана раньше. Структурная функция FeMoco заключается в объединении мономеров MoFe-белка в димеры. Участки белка (аргинин, лизин, аспартат, глутамат), связывающие FeMoco, существенно влияют на его электростатическое состояние.
Кроме нитрогеназы, содержащей молибден, выявлена альтернативная ванадиевая нитрогеназа (V-нитрогеназа). Ее существование доказано методами генной инженерии на примере штаммов двух видов азотобактера, лишенных структурных генов для Мо-содержащей нитрогеназы. Синтез этими бактериями V-нитрогеназы происходит в условиях дефицита молибдена и обеспеченности ванадием. V-нитрогеназа, как и Мо-нитрогеназа, состоит из двух компонентов — V-Fe-белка и Fe-белка. Уникальная способность V-нитрогеназы состоит в ее способности восстанавливать в ограниченном количестве ацетилен до этана.
Биосинтез. Биосинтез Moco состоит из четырех этапов. На первом этапе формируется белок, свободный от атомов серы, — предшественник Z. Эта реакция катализируется белками Сnх2 и СnхЗ, первый из них содержит Fe-S-кластер. На второй стадии сера транспортируется с участием молибдоптеринсинтазы к предшественнику Z и формируется птерин, не содержащий молибдена. На третьей стадии происходит связывание молибдоптерина с аденилатом, что сопровождается в присутствии Mg2+ гидролизом АТФ. Непосредственное образование Мосо, т. е. включение атомов молибдена в птерин, происходит на завершающем этапе с участием меди. В этом случае медь необходима для защиты от окисления дитиоловых групп молибдоптерина и/или подготовки его групп для связывания молибдена.
Вновь синтезированный Moco включается в состав апофермента или связывается с транспортным белком MCP (Мосо carrier protein), который защищает его от окисления до момента включения Мосо в состав Mо-фермента. Впервые такой белок массой 16 кД. способный защищать Мосо от окисления, обнаружен у зеленой водоросли
С. rhеinhardtii. У высших растений белок, гомологичный таковому у
С. rheinhurdtii, подобен лизинкарбоксилазе.
По электронной конфигурации Mo(VI) сходен с ванадием и особенно с вольфрамом, имеющим одинаковые с молибденом атомный и ионный радиусы, близкие значения электроотрицательности и других параметров, характеризующих комилексообразующие свойства. Функции вольфрама в ферментах примитивных организмов сопоставимы с функциями молибдена в ферментах высших организмов. Кроме того, в ферментах оба элемента (Mo и W) могут связываться одним и тем же лигандом. У большинства прокариот и эукариот вольфрам — антагонист молибдена и легко замещает последний в составе неактивных аналогов молибденсодержащих ферментов. Поэтому вольфрам часто используют при исследовании структуры и свойств молибденовых ферментов.
Большинство прокариот и эукариот легко замещают in vivo молибден в Мо-ферментах на вольфрам, в результате образуются неактивные вольфрамовые аналоги Мо-ферментов. Для нитратредуктазы это показано в работах, выполненных с растениями, грибами, водорослями, микроорганизмами. При этом инактивация Мо-ферментов, вызываемая вольфрамом, обычно обратима.
Вольфрам может также стимулировать нитратредуктазную активность у растений и микроорганизмов. Культивирование толерантных к избытку солей дрожжей
Rhodotorula glutinis в среде, одновременно содержащей молибден и вольфрам в эквимолярном количестве, сопровождалось стимуляцией вольфрамом активности нитратредуктазы. Однако в составе HP вольфрам не обнаружен, его действие проявлялось только на уровне экспрессии Мосо. В растительной ткани более 35% HP обнаруживается в состоянии холофермента — фермента с молибдокофактором, лишенным молибдена. Именно эта часть фермента, сохраняющая способность координировать металлы, может стабилизироваться, т. е. защищаться от протеолиза и других процессов, приводящих к инактивации фермента, вольфрамом.
Выявлены организмы, предпочитающие вольфрам молибдену. Например, из клеток гипертермофильных архей выделены ферменты: формиатдегидрогеназа, формат-дегидрогеназа, ферредоксиноксидоредуктаза редуктаза карбоксикислот и др., которые содержат в активном центре вольфрам и не способны замещать его молибденом. Кроме того, идентифицированы ферменты (формилметанофурандегидрогеназа, триметиламин-N-оксидредуктаза и др.), проявлявшие каталитическую активность как с молибденом, так и вольфрамом. Активный центр этих ферментов — молибдоптерин способен координировать тот и другой микроэлемент. Мезофильные микроорганизмы синтезируют преимущественно Mо-ферменты, тогда как гипертермофильные бактерии и архебактерии — W-ферменты. Археобактерии — наиболее древние организмы, поэтому предполагают, что кофактор этих ферментов, включающий молибдоптерин и вольфрам, но лишенный нуклеотида, был предком современных молибдокофакторов динуклеотидной природы.
Вероятно, в ходе эволюции жизненных форм возрастание биологической роли молибдена и снижение значения вольфрама происходило вследствие специфики физико-химических свойств этих элементов и смены условий среды обитания живых организмов. В анаэробных условиях вольфрам был доступнее организмам, чем молибден, так как вольфрамовые соединения лучше растворяются в сульфидной среде. В аэрируемых растворах, напротив, вольфрам формирует W(OH)4 — соединение, осаждающееся в слабокислой среде, а анион MoO4в2- остается в растворе. По этим причинам вольфрам в высших растениях не несет важной физиологической нагрузки и не рассматривается как необходимый микроэлемент.
В клетках восстанавливающей ванадат бактерии Pseudomonas isachenkovii (культивировали на среде с высоким содержанием ванадия: 0.S r/л) выделена периплазматическая HР, содержащая вместо молибдена ванадий. В форме HP, связанной с мембраной, ванадий не был обнаружен. Обе формы HP (периплазматическая и связанная с мембранами) не содержали молибдокофактора. Между содержанием в ферменте ванадия и нитратредуктазной активностью выявлена связь. Предполагают, что бактерии
P. isachenkovii реализовали в ходе эволюции независимый от Мосо путь диссимиляции нитратов.
Основная информация о таких Mo-ферментах, как нитратредуктаза, нитрогеназа и ксаитиндегидрогеназа, приведена раньше. Дополнительно отметим, что в связи с участием молибдена в восстановлении NO3- наибольшую потребность в этом микроэлементе испытывают растения, выращиваемые на нитратном, а не на аммонийном фоне. Этот вывод основан на результатах экспериментов, проведенных в стерильных условиях. Потребность в молибдене повышена у бобовых растений и у небобовых, способных к N2-фиксации. Так, молибденовые удобрения повышают содержание азота в листьях и урожай семян только у N-дефицитных растений сои, зараженных клубеньковыми бактериями. Однако у бобовых в присутствии нитратов активность нитрогеназы может быть подавлена, что объясняют перехватом в этих условиях потока электронов и АТФ нитратредуктазой, содержащейся в бактероидах клубеньков. Отметим, что эта точка зрения разделяется не всеми авторами. В клетках азотфиксаторов и бактероидах клубеньков HP и нитрогеназа конкурируют за молибден. У желтого люпина максимальная конкуренция проявляется в фазе бутонизации, когда синтез HP в листьях и нитрогеназы в клубеньках наиболее активен. При недостатке в среде молибдена нитрогеназа перехватывает этот элемент, что сопровождается значительным снижением активности HP. При выращивании бобовых на нитратном фоне конкуренция за молибден HP и нитрогеназы усиливается, а при достаточном снабжении растений молибденом элиминирует. Нитратредуктаза как Mo-фермент преобладает в листьях. Молибден необходим бобовым и для нормальной работы ксантинодегидрогиназы. Этот фермент катализирует метаболизм пуринов и контролирует формирование уреидов.
Альдегидоксидаза. Этот фермент очень похож на ксантиндегидрогеназу по молекулярной массе, гомологии, кофакторам, форме (состоит из двух субъединиц) и каталитическому действию. Судя по филогенетическому анализу альдегидоксидаза происходит от ксантиндегидрогеназы после дупликации античных генов. Относится к группе строгих оксидаз. т. е. этот фермент не способен связывать НАД+, используя кислород в качестве исключительного акцептора электронов и, как следствие, продуцируя пероксид водорода. Одна из изоформ альдегидоксидазы (ААО3) предпочтительно использует в качестве субстрата абсцизовый альдегид — предшественник фитогормона абсцизовой кислоты. Этот фитогормон необходим для регуляции многих процессов развития, а также осуществления ответных реакций растений на биотический и абиотический стресс. В условиях стресса (засоление, засуха и др.) или в отсутствие нитрата Мосо преимущественно приурочен к альдегидоксидазе. В результате проявляется универсальная реакция растений на стресс: накопление в растительных тканях АБK и торможение роста.
Сульфитоксидаза. Фермент хорошо изучен у микроорганизмов, катализирует окисление сульфита (SO3в2-) до сульфата (SO4в2-). В отличие от животных у растений сульфитоксидаза не содержит в своем составе цитохрома b5, Таким образом, растительная сульфитоксидаза — самый простой по структуре Mo-фермент, обнаруженный и клетках эукариот. Его окислительно-восстановительный центр содержит только Мосо. Восстановление сульфида сопровождается переносом двух электронов, восстанавливающих Mo-центр фермента: Mo (VI) до Mo(IV). В растениях сульфитоксидаза переносит электроны на молекулярный кислород, что сопровождается образованием пероксида водорода. В клетках животных электроны передаются на Fe3+-гем цитохрома b5 и в конечной стадии — на внешний акцептор электронов цитохром с.
Сульфитредуктаза. В растительных клетках сульфитредуктаза обнаружена в пероксисомах, ее роль в этих органеллах не совсем понятна. Возможно, этот фермент необходим для удаления из клетки сульфитов, накапливающихся вследствие разложения метионина и цистеина или поглощения больших количеств SO2 из атмосферы. Кроме того, функции сульфитредуктазы могут быть связаны с метаболизмом активных форм кислорода, поскольку пероксид водорода — продуцируемый ферментом продукт.
Описанные четыре Мо-фермента (нитратредуктаза, сульфитредуктаза, ксантиндегидрогеназа и альдегидоксидаза) подразделяют на две группы. Ферменты первой группы (нитратредуктаза, сульфитредуктаза) активируются сразу после присоединения Мосо. Для активации ферментов второй группы (ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы) после присоединения Мосо необходима еще одна стадия: присоединение к Мо-центру неорганической формы серы. Эта стадия в опытах in vivo может осуществляться с помощью белка АВАЗ, обладающего свойствами Мосо-сульфуразы. N-домен этого бел ка способен извлекать элементарную серу путем разложения L-цистеина. С-домен участвует в связывании обогащенного серой Мосо с целевым белком этой группы ферментов. Заключительная стадия присоединения серы представляет собой эффективный путь контроля в клетке количества активных форм ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы. Концентрация в клетке таких активных соединений, как фитогормоны и активные формы кислорода, продуцируемых с участием ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы, может быстро возрастать вследствие изменения соотношения между активными и неактивными формами ферментов второй группы. Быстрая индукция генов аbа3 обнаружена у A. thaliana в условиях засухи и солевого стресса.
Другие функции. Принято считать, что в составе ферментов молибден находится в состоянии Mo(YI) и Mo(Y). He исключают, однако, и более низких степеней окисления молибдена (III, IY). В активных центрах ферментов молибден может координироваться с гидроксильными и карбоксильными группами аминокислот, серой цистеина и гистилина, фланиновыми коэнзимами и субстратами. После исследования ксантиноксидазы методом ЭПР установлено, что вероятными лигандами молибдена в этом ферменте могут быть атомы серы и кислорода, в отличие от атомов азота. Функции молибдена состоят s транспорте электронов. Комплексообразующие свойства молибдена оказывают влияние на физико-химические свойства многих соединений растительной клетки. Молибден способствует стабилизации вторичной структуры нуклеиновых кислот. Он понижает гидратацию нуклеиновых кислот, образуя комплексы с функциональными группами, служащими гидратационными центрами. Стабилизация структуры нуклеиновых кислот и изменение их пространственной конформации под влиянием полимеров, образуемых Mo(YI), приводит к блокированию действия ДНК- и РНКазы. Интерпретация связей, образуемых молибдатом с нуклеиновыми кислотами, затруднена. Предполагают, однако, что эти связи типа водородных. В образовании координационных связей с молибденом участвуют и молекулы белка. При этом изменяется распределение электронов и объединяются электронные орбиты белка и молибдена. Такое комплексообразование происходит с переносом заряда. В результате могут изменяться конформация и каталитическая активность ферментов. В живых растительных клетках проявление молибденом регуляторной функции тесно связано со значением pH среды, определяющим образование или разрыв координационных связей молибдена с органическими соединениями.
Молибден способен оказывать антистрессовое действие, в частности, осуществлять криопротекторную функцию. Растения с нормальным содержанием молибдена в тканях лучше выживают в период промораживания, а их репарация после воздействия низких температур протекает быстрее. Под влиянием молибдена в тканях увеличивается содержание линоленовой кислоты и соответственно уменьшается содержание линолевой. Эти изменения коррелируйте морозостойкостью растений. Накопление ненасыщенных жирных кислот повышает текучесть мембран и увеличивает устойчивость клеток к действию низкой температуры. Механизм антистрессового действия молибдена связывают с регулированием активности альдегидоксидазы и нитратредуктазы. Такая регуляция может осуществляться при включении молибдокофактора в состав этих ферментов.
Содержание. Содержание молибдена в растениях сильно варьирует в зависимости от их видовых особенностей и почвенно-климатических факторов. Как правило, в бобовых растениях и небобовых, способных к N2-фиксации, накапливается больше молибдена, чем в растениях других семейств. До 90% представителей семейства бобовых концентрируют этот микроэлемент, и его уровень в растениях существенно превышает содержание в почве. Распределение молибдена по органам изменяется в ходе онтогенеза бобовых (рис. 2.14). У люпина в течение длительного периода вегетации молибден накапливается главным образом в стеблях и клубеньках. Онтогенез люпина, как и других бобовых, заканчивается накоплением молибдена в семенах. Этот процесс усиливается благодаря подкормкам молибденовыми удобрениями растений в периоды их максимальной потребности в этом микроэлементе. У неклубеньковых растений основное количество молибдена локализовано в надземных органах. Так, в листьях хлопчатника содержание молибдена в несколько раз больше, чем в его стеблях и корнях. У льна наибольшие количества молибдена обнаружены в стеблях, а у пшеницы в листьях.
При прочих равных условиях растения, выращиваемые на кислых почвах, содержат меньше молибдена, чем выращиваемые на нейтральных. Известкование кислых почв способствует мобилизации молибдена в почве и увеличению его поступления в растения, этот процесс у бобовых происходит интенсивнее, чем у злаковых. Антагонистами молибдена при поглощении выступают вольфрам и сульфаты. Фосфаты могут усиливатъ поглощение молибдена корнями растений.
Внесение Мо-удобрений в почву способствует обогащению этим микроэлементом практически всех органоидов клетки, но больше всего молибдена накапливается в надосадочной жидкости, ядрах и рибосомах. Молибден также обнаружен в выделенных препаратах ДНК.
