Метод Бремнера
Метод состоит в получении гидролизата в результате обработки почв 6н. раствором HCl при 12-часовом кипячении с последующим определением в нейтрализованном гидролизате: а) общего азота, б) N — NH4, в) суммы азота NH4 и гексозаминов, г) N серина и треонина, д) N аминокислот, е) суммы азота аммония, гексозаминов и аминокислот.
Ход анализа. Получение гидролизата. Для анализа используют воздушно-сухую почву, растертую и пропущенную через сито с отверстиями диаметром 0,15 мм. Навеску почвы, содержащую около 10 мг N, помещают в коническую колбу емкостью 125 мл. Колба должна закрываться пришлифованной стеклянной пробкой, снабженной обратным холодильником типа Либиха. К почве добавляют 2 капли октилового спирта (для предотвращения образования пены при получении гидролизата) и 20 мл 6 н. раствора HCl. Смесь хорошо перемешивают круговыми движениями колбы. Затем колбу ставят на электроплитку (с регулятором нагрева), включают водопроводную воду для охлаждения холодильника и постепенно доводят смесь до умеренного кипения, которое продолжают в течение 12 час. По окончании гидролиза содержимое колбы охлаждают, раствор отфильтровывают через воронку Бюхнера. При фильтровании используют широкогорлую отсасывающую колбу на 1 л, в которую для сбора фильтрата вставляют плоскодонную широкую пробирку с отметкой на 60 мл. Для сбора фильтрата также может быть использована высокая отсасывающая колба емкостью 250 мл. Остаток почвы промывают небольшими порциями воды (5—10 мл) до тех пор, пока объем фильтрата не достигнет 60 мл. Раствор охлаждают и нейтрализуют щелочью (pH 6,5 + 0,1). Сначала к гидролизату осторожно, при постоянном перемешивании добавляют 5 н. раствор NaOH, доводя гидролизаг примерно до pH 5. Для окончательной нейтрализации используют 0,5 н. раствор едкого натра. Ход нейтрализации контролируют измерением pH со стеклянным электродом.
Необходимо очень внимательно следить за прибавлением щелочи. Если в процессе нейтрализации раствор приобретет щелочную реакцию, это может повлечь к потерям аммиака и разложению гексозаминов. Нейтрализованный гидролизат с помощью небольшой воронки переносят в мерную колбу емкостью 100 мл. Пробирку и электрод несколько раз ополаскивают небольшими порциями воды, доводя объем гидролизата до 100 мл. Колбу закрывают пробкой, раствор перемешивают, переворачивая колбу вверх дном.
Гидролизат (до прибавления щелочи) может храниться в течение долгого времени без изменений, вызываемых микробиологическими процессами. В случае необходимости на этой стадии анализ можно приостановить.
Нейтрализовать можно только часть гидролизата. При этом фильтрат удобно довести до 50 мл в мерной колбе, откуда взять часть его (20—25 мл) и довести щелочью до pH 6,5, как указано выше. Нейтрализованный раствор разбавляют водой в мерной колбе до 50 мл. Этот прием позволяет, если необходимо, повторить нейтрализацию гидролизата.
Чтобы получить хорошо воспроизводимые результаты, перед отбором определенного объема нейтрализованного гидролизата на анализ нужно хорошо перемешивать раствор, переворачивая колбу вверх дном.
Анализ гидролизата. Определение в гидролизате азотсодержащих соединений сводится к переводу их азота в аммиачную форму, отгону NH3 и учету его объемным методом.
В процессе анализа соблюдают следующие условия.
1. Для отгона аммиака используют полумикродистилляционный прибор с применением пара, у которого отгонной колбой служит колба Кьельдаля емкостью 50 мл (или 100 мл).
2. Прибор предварительно нужно отрегулировать, так, чтобы за 1 мин. отгонялось 7—8 мл дистиллята и температура его не превышала 22°.
3. Перед отгоном NH3 приемник с борной кислотой помещают под нижний конец холодильника, чтобы он был примерно на 4 см выше раствора в приемной колбе. В ходе отгона NH3 конец холодильника не опускают в раствор дистиллята.
4. Все сухие реактивы прибавляют в дистилляционную колбу с помощью сухой небольшой воронки, нижний конец которой должен достигать расширенной части колбы.
Общий гидролизуемый азот. В отгонную колбу дистилляционного прибора емкостью 50 мл помещают 5 мл нейтрализованного гидролизата и в ней проводят сжигание органических соединений (присутствующих в гидролизате) по Кьельдалю. К раствору прибавляют 0,5 г смеси катализаторов и сернокислого калия и 2 мл концентрированной серной кислоты. Смесь постепенно нагревают. После удаления из раствора воды и прекращения пенообразования раствор доводят до умеренного кипения, которое продолжают 1 час. Затем колбе дают охладиться, в нее добавляют при постоянном перемешивании раствора небольшими порциями 10—15 мл воды. Колбу охлаждают под струей водопроводной воды и помещают в сосуд с мелко наколотым льдом. Охлаждение раствора льдом способствует уменьшению образования пены при последующем добавлении к нему щелочи. Если эта операция вызывает трудности, ее можно не проводить.
В приемник прибора, которым служит коническая колба емкостью в 50 мл с отметкой на 35 мл, помещают 5 мл 2 %-ного раствора H3BO3, содержащего индикатор, и ставят под холодильник аппарата. К прибору присоединяют отгонную колбу с охлажденным раствором. Через воронку прибора постепенно добавляют в дистилляционную колбу 10 мл 10 н. раствора NaOH. Когда в воронке останется около 0,5 мл щелочи, ее быстро ополаскивают примерно 5 мл воды, спускают около 3 мл раствора и закрывают воронку. Подводят пар в дистилляционную колбу из парообразователя и отгоняют аммиак. Отгон заканчивают, когда в приемнике наберется 35 мл дистиллята (до метки на колбе). Конец холодильника ополаскивают водой. Раствор титруют 0,005 н. H2SO4, используя микробюретку (1 мл 0,005 н. H2SO4 соответствует 0,07 мг N). Конец титрования устанавливают по переходу зеленой окраски раствора в малиново-красную. На дистилляцию затрачивают 4 мин.
Азот аммония. В приемный сосуд, которым служит коническая колба емкостью 50 мл с отметкой на 20 мл, наливают 5 мл раствора борной кислоты, содержащей индикатор. Колбу ставят под холодильник прибора, как указано выше. В дистилляционную колбу помещают 10 мл нейтрализованного гидролизата, прибавляют 0,07+0,01 г MgO, присоединяют колбу к дистилляционному прибору и отгоняют NH3. Дистилляцию заканчивают, когда в приемной колбе соберется 20 мл раствора (на отгон затрачивают около 2 мин.). Обмывают конец холодильника водой и титруют дистиллят 0,005 н. H2SO4, используя микробюретку (1 мл 0,005 н. H2SO4 соответствует 0,07 мг N - NH4).
При соблюдении описанных условий (небольшое количество MgO и короткий период дистилляции NH3) присутствующие в гидролизате глюкозамины и другие неустойчивые азотсодержащие органические соединения не подвергаются минерализации.
Азот аммония и гексозаминов. Метод основан на разложении глюкозаминов и галактозаминов в щелочной среде с выделением NH3. Дистилляцию аммиака проводят при pH 11,2, создаваемым фосфатно-боратным буферным раствором.
В дистилляционную колбу емкостью 100 мл помещают 10 мл гидролизата, прибавляют 10 мл фосфатно-боратного буферного раствора. Определяют количество отогнанного NH3 тем же способом, что и общий азот в гидролизате. Аммиак отгоняют около 4 мин.
В процессе получения гидролизата часть гексозаминов минерализуется с отщеплением NH3. Поэтому при расчете азота гексозаминов, присутствующих в почве, величины азота, полученные при анализе гидролизата, нужно помножить на коэффициент 1,143.
Азот серина и треонина. После удаления из гидролизата азота аммония и гексозаминов (дистилляцией NH3 в присутствии фосфатно-боратного буферного раствора) от прибора отсоединяют дистилляционную колбу, споласкивают конец трубки прибора (вынутой из дистилляционной колбы) 3—5 мл воды, которую сливают в дистилляционную колбу. Колбу охлаждают под струей водопроводной воды. Прибавляют 2 мл раствора йодной кислоты, перемешивают вращением колбы в течение 30 сек., добавляют 2 мл раствора мышьяковистокислого натра и присоединяют колбу к прибору. Определяют содержание аммиака, соблюдая условия анализа, описанные при определении общего азота в гидролизате.
Выделение аммиака при взаимодействии серина и треонина с ионом йодной кислоты обычно идет по реакции
R1*CH(OH)*CH(NH2)R2+NaJO4 = R1*CHO+R2*CHO+NH3+NaJO3.
Избыток иона йодной кислоты восстанавливают мышьяковистокислым натром.
Азот аминокислот. Определение основано на переводе азота а-аминокислот при взаимодействии с нингидрином в аммиачную форму (после предварительного удаления из раствора аммонийного азота и азота гексозаминов).
В дистилляционную колбу емкостью 50 мл помещают 5 мл гидролизата, туда же приливают 1 мл 0,5 н. раствора NaOH. Колбу опускают в кипящую водяную баню и выдерживают там до уменьшения объема раствора до 2—3 мл (примерно 20 мин.). Колбу охлаждают, в нее прибавляют 500 мг лимонной кислоты, 100 мг нингидрина и снова помещают в сильно кипящую водяную баню так, чтобы расширенная часть колбы была полностью погружена в воду. Примерно через минуту смесь, не вынимая колбы из воды, взбалтывают и дополнительно оставляют на 9 мин. Затем колбу вынимают из бани, охлаждают, прибавляют 10 мл фосфатно-боратного буфера и 1 мл 5 н. NaOH, присоединяют к дистилляционному прибору, отгоняют NH3 и определяют содержание его (см. анализ общего азота в гидролизате).
Азот аммония, гексозаминов и аминокислот. Помещают 5 мл гидролизата в дистилляционную колбу емкостью 50 мл, прибавляют 100 мг лимоннокислого буферного реактива и 100 мг нингидрина. Колбу опускают в сильно кипящую водяную баню, чтобы расширенная ее часть полностью находилась в воде. После минутного выдерживания (не вынимая колбы из бани) содержимое ее перемешивают взбалтыванием в течение нескольких секунд и оставляют в бане еще на 9 мин. Затем колбу вынимают, охлаждают, прибавляют 10 мл фосфатно-боратного буферного раствора и присоединяют к прибору. Определяют количество отогнанного NH3, соблюдая условия анализа определения общего азота в гидролизате.
Метод не позволяет полностью учесть азот гексозаминов; последние реагируют с нингидрином, образуя соединения, из которых азот в виде NH3 количественно не выделяется. Однако содержание в гидролизате азота гексозаминов обычно намного меньше, чем азота аммония и аминокислот. В связи с этим результаты, полученные описанным методом, немного занижены. Метод отличается простотой, быстротой выполнения и вполне пригоден для исследовательских работ, где не требуется особо высокая точность анализов.
Параллельно с анализом гидролизата необходимо проводить холостые определения возможного загрязнения реактивов соединениями азота. При расчетах анализа вносят соответствующие поправки.
Реактивы. 1. Концентрированная серная кислота (уд. вес. 1,83—1,84).
2. 6 н. раствор соляной кислоты (приблизительно). К 490 мл соляной кислоты (уд. вес 1,19) прибавляют 300 мл воды. Раствор доводят водой до 1 л в мерной колбе, хорошо перемешивают.
3. н-октиловый спирт.
4. Смесь катализаторов и сернокислого калия. Смешивают 100 г K2SO4, 10 г CuSO4*5Н2О и 1 г Se после предварительного растирания в порошок отдельно каждого реактива. Смесь тщательно перемешивают и дополнительно растирают в ступке.
5. 10 н. раствор NaOH (приблизительно). Растворяют в большой фарфоровой чашке при размешивании 2,1 кг NaOH в 2 л воды. Охлажденный раствор переносят в склянку, закрывают резиновой пробкой. Через несколько дней светлый раствор над осадком сливают сифоном. Разводят водой, не содержащей CO2, до 5 л. Хранят в бутыли с предохранителем от CO2 атмосферы.
6. 5 н. раствор NaOH (приблизительно). Разводят в 2 раза реактив 5. Хранят в хорошо закрытой бутыли.
7. 0,5 н. раствор NaOH (приблизительно). Разводят водой 50 мл реактива 5 до 1 л. Хранят в хорошо закрытой бутыли.
8. 2%-ный раствор борной кислоты, содержащей индикатор. Растворяют 2 г х. ч. H3BO3 в 700 мл горячей воды. Остывший раствор переносят в литровую мерную колбу, содержащую 200 мл этилового спирта и 20 мл смеси индикаторного раствора. Последний готовят растворением 0,33 г бромкрезолового зеленого и 0,165 г метилового красного в 500 мл этилового спирта. После смешивания к содержимому колбы прибавляют небольшими порциями 0,05 н. раствор NaOH до изменения цвета от малиново-красного до бледно-зеленого. Количество добавляемой щелочи устанавливают предварительно в отдельной пробе. Для этого берут 10 мл раствора борной кислоты с индикатором, прибавляют 10 мл воды и из бюретки по каплям добавляют 0,05 н. раствор NaOH до приобретения раствором бледно-зеленого цвета. Рассчитывают количество щелочи, потребное для всего раствора.
Смесь индикаторов бромкрезолового зеленого и метилового красного можно заменить смешанным индикатором Гроака (см. выше метод Кьельдаля).
9. 0,005 н. титрованный раствор H2SO4.
10. Окись магния.
11. Нингидрин (C9H4O3*H2O), сухой реактив, растертый в порошок.
12. Фосфатно-боратный буферный раствор (pH 11,2). В 900 мл воды растворяют 100 г Na3PO4*12Н2О и 25 г Na2B4O7*10H2O. Раствор в мерной колбе доводят водой до 1 л. Хранят в хорошо закрытой бутыли.
13. Лимонная кислота, х. ч. Реактив растирают до тонкого порошка. Хранят в небольшой широкогорлой банке.
14. Цитратный буферный реактив (pH 2,5). Смешивают 2,06 г лимоннокислого натра (Na3C5H6О7*2H2О) и 19,15 г лимонной кислоты (C6H8O7*H2O). Растирают в тонкий порошок в фарфоровой ступке. Хранят в небольшой широкогорлой банке.
15. Раствор йодной кислоты. Готовят приблизительно 0,2 M раствор. Растворяют 4,6 г йодной кислоты (HJО4*2H2О) в 100 мл воды. Раствор хранят в склянке, плотно закрытой стеклянной пробкой.
16. Мышьяковистокислый натр (мета). Готовят приблизительно 1 M раствор. Растворяют 13 г NaAsO2 (ч. д. а.) в 100 мл воды. Хранят в хорошо закрытой склянке.
