Определение аминокислотного состава по Турчину
Для извлечения аминокислот применяют гидролиз почвы 6 н. раствором серной кислоты. Из гидролизата аминокислоты выделяют Н-катионитом и далее разделяют их с помощью бумажной хроматографии. Метод позволяет выделить следующие аминокислоты: цистин, треонин, аланин, пролин, тиразин, триптофан, валин, лейцин + изолейцин, фенилаланин, аспарагин, серин, гликоколь, глютаминовую и аспарагиновую кислоты.
Ход анализа. Навеску почв 20 г помещают в колбу, туда же прибавляют 100 мл 6 н. раствора H2SO4. Содержимое колбы доводят до слабого кипения, которое продолжают 24 час. (при кипячении применяют обратный холодильник), затем раствор охлаждают, отфильтровывают. Для осаждения серной кислоты к фильтрату прибавляют раствор Ba(OH)2; осадок BaSO4 отделяют фильтрованием. Кальций и полуторные окислы, перешедшие в гидролизат из почвы, а также избыток бария удаляют прибавлением раствора углекислого аммония. Осадок отфильтровывают и полученный фильтрат пропускают через колонку, наполненную Н-катионитом (могут быть использованы эспатит, вофатит и т. п.). В этих условиях аминокислоты полностью сорбируются катионитом, присутствующие в гидролизате другие органические соединения и неорганические кислотные остатки уходят в фильтрат при последующем промывании катионита водой.
Для извлечения сорбированных катионитом аминокислот применяют многократное встряхивание катионита с CaO (1 г CaO на 10 г катионита) и с 2%-ным водным раствором аммиака, добиваясь полного извлечения аминокислот. Отсутствие розовой окраски в последних порциях элюата при прибавлении нингидрина указывает на полноту извлечения аминокислот. Элюат выпаривают досуха в фарфоровых чашках на водяной бане. Остаток растворяют в точно отмеренном небольшом объеме воды (3—5 мл). Для разделения аминокислот отбирают микропипеткой 0,01—0,04 мл раствора, наносят его на хроматографическую бумагу № 3. Бумагу предварительно обрабатывают фосфатно-цитратной буферной смесью, имеющей pH 7,8. Ее готовят, смешивая 191,5 мл 0,2 M раствора Na2HPO4*2Н2О и 8,5 мл 0,1 M раствора лимонной кислоты.
Для разделения аминокислот применяют два растворителя: 1) насыщенный водный раствор фенола и 2) смесь амилового спирта, изопропилового спирта, уксусной кислоты и воды при соотношении 4:4:1:1. Локализованные на бумаге аминокислоты проявляют нингидрином (0,2 %-ный раствор нингидрина в насыщенном водой н-бутиловом спирте). Рекомендуемый автором способ весьма точно локализует отдельные аминокислоты, что позволяет полностью отделить их друг от друга.
Окрашенные участки бумаги, на которых локализованы отдельные аминокислоты, после проявления их нингидрином, вырезают из хроматограммы и обрабатывают буферным раствором веронала (pH 7,0). Раствор готовят, смешивая 53,6 мл 0,1 M натрий-веронала (20,62 г/л) и 46,4 мл 0,1 M раствора HCl. Окраска пятен полностью переходит в раствор. Оптическую плотность раствора измеряют с помощью спектрофотометра или фотоколориметра. Сравнивая полученные показания с градуировочной кривой образцовых растворов отдельных аминокислот (предварительно подвергшихся такой же обработке на хроматографической бумаге), определяют содержание аминокислот в почве. Точность анализа + 5%.
