Методика подготовки почвенных образцов для измерения изотопного состава азота
При проведении почвенных и агрохимических исследований азота с применением метода меченых атомов в качестве индикатора используют стабильный изотоп азота — 16N.
Из известных шести изотопов азота два — с массой 14 и массой 15 — являются стабильными. Остальные четыре обладают радиоактивностью, однако широкого практического применения они не получили в связи с коротким периодом распада. Наиболее долгоживущий радиоактивный изотоп азота (с массой 13) имеет период полураспада около 10 мин.
Природный азот состоит из двух стабильных изотопов — азота 14 и азота 15. В азоте воздуха содержится 99,635 ат. % 14N и 0,365 ат.% 15N. Для почв могут наблюдаться некоторые отклонения от этого соотношения изотопов. По данным Бремнера с соавт., в изученных ими почвах величины 16N составляли 0,3651—0,3729 ат.%.
Методы определения концентрации 18N (ат. % 15N) основаны на измерении изотопного состава азота исследуемого образца и совершенно отличны от тех, которые используются при применении радиоактивных изотопов, основанных на определении интенсивности излучения.
Использование стабильных изотопов в качестве индикаторов (в том числе и 15N) не позволяет применять таких больших разбавлений, как при работе с радиоактивными изотопами. Это является недостатком метода. Однако при работе со стабильными изотопами не возникает опасности в отношении влияния радиации на биологические процессы и не требуется соблюдения специальных мер предосторожности, которые необходимы при работе с радиоактивными изотопами.
Для анализа изотопного состава азота используют масс-спектрометры или эмиссионные спектрометры. В обоих случаях наиболее удобным веществом для анализа изотопного состава этого элемента является газообразный азот (N2).
Чтобы получить хорошо воспроизводимые результаты с помощью масс-спектрометра, требуется 1—3 мг азота. Эмиссионный же спектрометр (типа NOJ-4) позволяет измерять изотопный состав при наличии около 0,01 мг азота. Поэтому эмиссионные спектрометры более широко применяются при проведении биохимических исследований, где получение азота порядка нескольких миллиграмм часто встречает определенные трудности в связи с ограниченностью анализируемого материала.
В агрохимических исследованиях количество подвергающегося анализу материала (почвенные и растительные образцы) обычно не является лимитирующим фактором. В то же время благодаря неоднородности растительных и особенно почвенных образцов возникают значительные трудности при взятии небольших навесок, представляющих среднюю пробу анализируемого образца. Поэтому при анализе почвенных и растительных образцов на изотопный состав азота, независимо от прибора, каким будет производиться измерение, целесообразно брать навески размером, рекомендуемым при проведении химических анализов и далее уже использовать необходимые количества N5 для измерения изотопного состава.
Измерение изотопного состава азота позволяет установить лишь концентрацию 15N в анализируемом образце. Чтобы определить содержание 15N, присутствующего в почве в виде какого-либо соединения, помимо изотопного состава, определяют величины азота этого соединения химическим методом одновременно с подготовкой образцов газообразного азота для изотопного анализа.
При анализе почвенных образцов, обогащенных 15N, газообразный азот удобно получать в две стадии: 1) перевод анализируемых соединений азота в аммиачную форму и отгон NH3; 2) окисление аммиака до элементарного азота гипобромитом натрия (или лития).
Анализ изотопного состава азота описан в специальной литературе и в настоящей работе не рассматривается.
Перевод азота образцов в аммонийную форму с последующим отгоном NH3 представляет собой ход выполнения соответствующих химических анализов. Однако не все методы могут быть для этого применимы. Пригодны методы, которые после отгона аммиака и окисления его до элементарного азота исключают присутствие в последнем соединений, влияющих на измерения изотопного состава азота (метиламин, диметиламин, аминокислоты, CO, O2 и др.).
Значительное количество тяжелого изотопа азота может присутствовать в почвах в форме нитратов. При определении общего содержания 15N в почве для окисления органического вещества следует применять варианты метода Кьельдаля, включающие нитраты, с применением для сжигания фенолсерной или салициловой кислоты. Чтобы гарантировать полноту окисления органического вещества, сжигание ведут 15—18 час. Присутствие ряда органических соединений в образцах N2, идущих на измерение изотопного состава, благодаря неполноте окисления органических веществ почвы при сжигании может внести значительные ошибки в результаты измерения.
Когда предполагают измерять изотопный состав отдельных соединений азота, например обменного аммония или нитратов, их извлекают из почвы, применяя солевые вытяжки, и отгоняют NH3 в присутствии MgO (при определении нитратов их предварительно восстанавливают до аммиака). Ход анализа описан выше.
Дистилляцию NH3 удобно проводить в аппарате, показанном на рис. 2. Прибор позволяет отгонять до 5 мг N — NH3, обладает высокой производительностью, легко разбирается, что представляет большое удобство в связи с необходимостью очищать прибор от загрязнения 15NH3.
После отгона NH3 в дистилляте определяют содержание аммиачного азота титрованием. Затем раствор доводят до слабокислой реакции, прибавляя несколько капель 0,02 н. H22SO4, и выпаривают в фарфоровых чашках на водяной бане до 2—5 мл. При этом из жидкости удаляется растворенный в ней N2 и этиловый спирт, внесенный вместе с индикатором. Отгон аммиака лучше проводить в титрованный раствор серной кислоты, а не борной. При использовании борной кислоты в конце выпаривания дистиллята из раствора может выкристаллизоваться борная кислота.
Для получения надежных результатов изотопного анализа в упаренном дистилляте содержание аммиачного азота не должно быть ниже 0,5 мг в 1 мл. Упаренные растворы переносят в пробирки, которые закрывают пробками. Перенесение оставшегося на стенках чашек раствора споласкиванием водой не требуется (изотопный анализ устанавливает соотношение 16N к 14N, а не определяет содержание этих изотопов в образце). Далее приступают ко второй стадии — окислению аммиака в элементарный азот.
Чтобы избежать ошибок в результатах анализа изотопного состава, при выполнении первой стадии работы необходимо соблюдать следующие условия:
1. Выбор химических методов для подготовки образцов газообразного азота должен обеспечить отсутствие в N2 примесей, мешающих определению изотопного состава азота.
2. Внесенные в почву соединения азота, меченные 15N, распределяются в ней микроочагами. Кроме того, отдельные азотсодержащие компоненты почвы могут различно обогащаться добавляемым в почву тяжелым изотопом азота. Например, азот нитратов или обменного аммония может приобрести более высокое обогащение, чем азот органических соединений почвы. Это создает большую пестроту в распределении 15N, поэтому необходимо исключительно тщательно брать навески почвы (особенно небольшие), чтобы они представляли среднюю пробу анализируемого образца.
3. В процессе отгона аммиака в стеклянных дистилляционных аппаратах некоторое количество его задерживается на стеклянной поверхности каплеуловителя и холодильника. Из-за этого при отгоне 15NH3 прибор загрязняется тяжелым изотопом азота. При дистилляции через прибор следующего образца часть удерживаемого стеклом 15NH, будет освобождаться и переходить в дистиллят. Это поведет к ошибке в изотопном составе азота последнего образца. Ошибка может достигнуть значительных размеров, если отгоняется аммиак с низким обогащением после высокообогащенного.
При подготовке образцов для определения изотопного состава следует изготовлять каплеуловители и внутреннюю часть холодильника дистилляционных аппаратов из кварцевого стекла; оно практически не сорбирует на своей поверхности аммиак. Стекло 46 (молибденовое) не может быть использовано. Холодильники и каплеуловители из этого стекла сильно загрязняются 15NH3. Для очистки стекла Бремнер рекомендует между отгонами аммиака, обогащенного 15N, применять дистилляцию этилового спирта (20 мл). Этот прием дает положительные результаты при работе со стеклом, удерживающим на своей поверхности небольшое количество аммиака. После отгона 14NH, с высоким обогащением (выше 50%) даже при использовании приборов из кварцевого стекла необходимо очищать холодильники и каплеуловители отгоном этилового спирта или длительной дистилляцией водяного пара (не менее часа).
Следует систематически контролировать загрязнение дистилляционных приборов тяжелым изотопом азота путем отгона через прибор необогащенного аммиака из (NH4)2SO4 или NH4Cl с последующим анализом его изотопного состава. Если при этом атомный процент будет выше, чем у природного азота, значит прибор загрязнен и его необходимо подвергнуть очистке (дистилляцией спирта или водяного пара).
4. Ошибку в данные изотопного состава азота может внести загрязнение применяемых при анализе реактивов. Присутствие в них соединений азота, которые в процессе анализа могут быть переведены в элементарный азот, вызовет разбавление меченого азота исследуемого образца. Этот источник ошибок обычно недоучитывается.
Значимость такой ошибки можно видеть из следующего примера. Допустим, что анализируемый образец содержит 2,0 «Ne обогащением 3,00 избытка ат. % 15N. Холостое определенпе показало содержание в реактивах 0,2 мг азота. В результате разбавления образца азотом реактивов изотопный анализ покажет вместо 3,00 только 2,73 избытка ат.% 16N, т. е. ошибка определения составит 9% (относительных). Пример очень упрощен Процесс разбавления образца азотом реактивов более сложен. Это не позволяет вносить поправку на загрязнение реактивов, аналогично тому, как это делается при химическом анализе на основании холостого определения.
Все реактивы, применяемые для анализа, должны быть проверены на загрязнение их соединениями азота. Если применяемый NaOH содержит аммиак, после приготовления щелочи ее кипятят в течение нескольких часов для удаления NH3 (в медной посуде), затем концентрацию NaOH доводят до исходной прибавлением воды. Чтобы уменьшить загрязнение серной кислоты, ее перегоняют. При анализе необходимо использовать дистиллированную воду, не содержащую аммиак. Для этого в воду добавляют алюмокалиевые квасцы (или подкисляют ее серной кислотой) и вторично перегоняют, соблюдая условия, исключающие поглощение водой аммиака из воздуха.
5. Выпаривать дистилляты на водяной бане следует в фарфоровых чашках, а не в стеклянной посуде, которая значительно сильнее загрязняется 15NH3 и труднее подвергается очистке.
Окисление аммиака до элементарного азота может быть проведено непосредственно после упаривания дистиллята или отложено. В последнем случае сконцентрированные растворы хранят в закрытых пробирках в холодильнике.
Окисление аммиака до элементарного азота проводят гипобромитом натрия (или лития). Реакция протекает в щелочной среде:
2NН3 + 3NаВrО → N2 + 3Н2О + 3NaBr.
Приготовление гипобромита: в 300 мл воды растворяют 200 г NaOH. Раствор охлаждают льдом. Половину охлажденного раствора помещают в широкогорлую коническую колбу, которую погружают в сосуд, содержащий мелко наколотые кусочки льда, и небольшими порциями добавляют 60 мл брома, хорошо перемешивая раствор после каждого прибавления. Скорость прибавления Br2 регулируют, чтобы температура смеси не поднималась выше 5° (в раствор погружают термометр). Операция занимает не менее 30 мин. Ее проводят под тягой в резиновых перчатках. Когда весь бром прибавлен, к смеси добавляют оставшуюся половину NaOH, перемешивают несколько минут, затем колбу закрывают пробкой и оставляют в холодильнике на 4—6 дней. За это время на дне колбы образуется осадок NaBr. Раствор отделяют декантацией или фильтрованием через стеклянные фильтры с применением отсасывания. Полученный прозрачный раствор разбавляют равным объемом раствора, содержащего 2 г KJ в 1 л воды. На окисление 5—6 мг N-NH3 расходуется 1 мл этого реактива. Раствор хранят в плотно закрытой склянке в холодильнике. В этих условиях он не теряет своей окисляющей способности в течение 6 мес.
Чтобы избежать разбавления получаемого N2 при окислении аммиака азотом воздуха, реакцию проводят в специальной вакуумной установке, предложенной Д. Риттенбергом, при разряжении не хуже 10в-3 мм. Газообразный азот собирают в ампулы, которые далее поступают на изотопный анализ.
В последнее время эту операцию стали проводить в специальных приставках, непосредственно соединенных с напускной системой приборов, измеряющих изотопный состав азота. Ее выполняют лица, проводящие изотопный анализ. Это позволило значительно повысить производительность выполнения анализа и исключить дополнительные возможности загрязнения образцов при окислении аммиака в вакуумных установках.
