Дифференциальное центрифугирование клеточных структур (часть 2)
Лейбих (циг. по С. Граник, 1962) установил, что в меристематических тканях железо необходимо для синтеза железосодержащих ферментов митохондрий; 82% его сосредоточено в хлоропластах, в ядрах найдены только следы. В то же время А.Ф. Агафонова, Н.С. Чаплыгина (1962), исследуя поглощение железа растениями и его распределение внутри клетки, приходят к выводу, что в клеточных ядрах паренхимы листьев кукурузы содержалось больше железа, чем в хлоропластах и структурах митохондриального типа. Содержание железа в последних было ниже, чем в хлоропластах.
В работе Дж. Скока (1962) приводятся некоторые данные о локализации бора в клеточных структурах. Автор указывает, что митохондрии и микросомы содержат меньше бора, чем ядра, пластиды и надосадочная жидкость. Для осуществления различных клеточных функций используется бор, содержащийся в диализируемой фракции надосадочной жидкости.
Мы совместно с З.М. Климовицкой, Л.Д. Лейденской и Э.В. Рудаковой в 1961—1953 гг. изучали локализацию микроэлементов марганца, молибдена и цинка в клеточных структурах растений, а также содержание микроэлементов в связи с онтогенезом растений. Был использован метод дифференциалы ого центрифугирования, дающий возможность выделить цитоплазму и органоиды клетки: ядра, хлоропласта, митохондрии. Мы придерживались методики выделения клеточных структур, предложенной Н.С. Сисакяном, И.М. Мосоловой (1961—1962).
В 1961 г. работу проводили на центрифуге с охлаждением и общей разрешающей способностью 30 000 g. Из гомогенатов листьев сахарной свеклы (сорт Верхнячская 020) в 0,35 M растворе сахарозы при 2500 g выделены крупные фрагменты клеток, при 4500 g — хлоропласта, при 17 000 g — митохондрии. Выделенные фракции сжигали. В полученной золе определяли марганец. Содержание его выражали в миллиграммах в пересчете на ту или иную фракцию, выделенную из 1 кг сырого вещества растении. Так, в крупных фрагментах клеток содержалось 20,88 мг/кг марганца, или 44,5%; в хлоропластах — 3,46, или 7,5; в митохондриях — 2,05, или 4,3; в незеленых цитоплазменных структурах — 20,43 мг/кг, или 43,7%. Препараты хлоропластов идентифицировали по их характерной люминесценции.
Максимальное количество марганца содержалось в незеленых цитоплазменных структурах и крупных фрагментах клеток. При пересчете на содержание марганца в золе каждой фракции максимальное количество его отмечено для фракции хлоропластов и митохондрий. В крупных фрагментах клеток содержалось 325,1 мг марганца на 100 г золы, или 16,3%; в хлоропластах — 823,9, или 42,5; в митохондриях — 500, или 25,1; в незеленых цитоплазменных структурах — 321 мг, или 16,1%, марганца.
В 1962 г. нами была принята следующая методика работы по изучению содержания марганца, молибдена и цинка в клеточных структурах листьев конских бобов и сахарной свеклы. Бобы (сорт Херц-Фрея) и сахарную свеклу (сорт Рамонская 04) выращивали на стационаре опытного хозяйства Института физиологии растений АН УССР на лугово-черноземной оподзоленной почве по фону NPK с добавлением марганца, молибдена и цинка. В начале, середине и конце вегетации мы брали навески листьев (30 г сырого вещества), затем их растирали на льду с 40 мл 0,5 M сахарозы и 10 мл фосфатного буфера (по Серенсену); pH среды 7,1. Полученные гомогенаты подвергали дифференциальному центрифугированию на центрифуге ТМ-14, разрешающая способность которой 20 000 g. Вначале из гомогенатов удаляли крупные фрагменты клеток. Затем на центрифуге при 1500 и 3000 g в течение 10 мин выделяли более мелкие фрагменты (осколки) клеток. Отмечено, что при 3000 g в течение 10 мин оседали ядра. Хлоропласты выделяли в течение 15 мин при 6000 — 10 000 g, а при 14 000 g — митохондрии. Выделенные фракции подвергали повторному центрифугированию с 2 мл сахарозы в течение 10—15 мин при соответствующих для каждой фракции значениях оборотов. Полученные фракции сжигали в муфеле, а в их золе определяли марганец, молибден, цинк. В оставшейся надосадочной жидкости также определяли содержание этих микроэлементов.
Фракции подвергали гистологическому анализу. Под микроскопом просматривали клеточные оболочки, ядра, хлоропласты. Митохондрии нам не удалось идентифицировать. У листьев бобов оказались очень тяжелые форменные элементы; это были преимущественно хлоропласты, которые при 3000—6000 g почти полностью осаждались. Надосадочная жидкость была прозрачной. У сахарной свеклы хлоропласты лучше всего осаждались при 6000—10 000 g. Совершенно прозрачной надосадочной жидкости не удавалось получить даже при 14 000 g. Этим, очевидно, объясняется отсутствие единой методики выделения клеточных структур. Разная степень оседания клеточных структур требует дифференцированных методик их выделения с учетом биологических особенностей каждой культуры.
Количество микроэлементов в клеточных структурах, выделенных методом дифференциального центрифугирования, рассчитывали в миллиграммах на 1 кг сырого вещества навески, в процентах от общего содержания и в миллиграммах на 100 г золы каждой фракции.
Из клеточных структур листьев сахарной свеклы максимальное количество марганца (при пересчете на фракцию, выделенную из 1 кг сырого вещества) сосредоточивается в надосадочной жидкости, т. е. в цитоплазме; в крупных фрагментах клеток (хлоропластах, ядрах, митохондриях) он содержится в убывающем порядке. К середине вегетации количество марганца в листьях сахарной свеклы (табл. 45) возрастает за счет увеличения содержания его в крупных фрагментах клеток и надосадочной жидкости. В органоидах клетки (ядрах, хлоропластах, митохондриях) оно остается довольно постоянным в течение всего периода вегетации.
