Специфическая реакция растений на дефицит железа
К настоящему времени наиболее детально изучена специфическая реакция растений на дефицит железа. Эта реакция обусловлена комплексом адаптивных механизмов. Химические способы повышения растворимости и доступности железа растениям ограничиваются восстановлением Fe(III) до Fe(II), уменьшением pH ризосферы и продуцированием растением хелатирующих соединений. Видовые различия между адаптивными реакциями растений ка дефицит железа классифицируют как стратегию I и стратегию II.
Стратегия I. Растения этой группы характеризуются двумя четкими физиологическими реакциями на Fe-дефицит: повышением в клетках корней нетто-экскреции корнями протоков и активацией Fe2+-хелатредукгаз. Во многих случаях эти реакции сопровождаются продуцированием корнями редуцирующих или хелатирующих низкомолекулярных органических соединений.
Выделение Н+ связано с работой Н+-АТФаз в плазмалемме корня, их активность в условиях Fе-дефицита может возрастать на 18-100%. При этом снижение значений pH в ризосфере, четко регистрируемое различными методами, достигает в зависимости от особенностей растений и буферной способности почвы двух единиц и более. Подкисление ризосферы способствует повышению растворимости и доступности растениям оксидов железа, а также созданию условий, благоприятных для работы Fe3+-релуктаз. Белок индуцируемой Fe-дефицитом H+-АТФазы до сих пор не идентифицирован, но выявлены вовлеченные в этот процесс гены семейства AHA: Н+-АТФаза Arabidopsis.
При дефиците железа в эпидермальных клетках корней Arabidopsis обнаружена экспрессия генов FRO2, кодирующих синтез Fе(III)-хелатредуктазы. Повышение редукгазной активности ведет к интенсивному восстановлению растворимых Fe(III)-Xeлатов и увеличению скорости их расщепления, что необходимо, по-видимому, для успешного поглощения железа корнями. Экспрессия генов семейства FRO в условиях Fe-дефицита может происходить не только в эпидерме, но и в сосудах центрального цилиндра корня, что свидетельствует о вовлеченности Fe-редуктаз как в поглощение из почвы, так и в ксилемную загрузку железа. В условиях недостатка железа доказана необходимость транскрипции генов AtBHLH29, кодирующих синтез белка BHLH для экспрессии генов AtFRO2, в отличие от AtIRT1, кодирующих синтез Fe-HATS.
Регуляция ответных реакций стратегии I, по-видимому, осуществляется с участием генов семейств FER, кодирующего синтез основного транскрипционного фактора bHLH. Мутант томата fer оказался неспособным индуцировать механизмы стратегии I в ответ ка Fe-дефицит. Причем экспрессию генов FER наблюдали как во внешнем слое коры кончиков корней, так и в области расположения сосудов в зоне корневых волосков. Эти данные позволяют предположить, что белок FER участвует как в регуляции поглощения железа из почвы, так и в распределении поглощенного железа уже в самом растении. Содержание белка FЕR в растениях зависит от их обеспеченности железом. В трансгенных растениях томатов этот белок обнаружен в диапазоне внешних концентраций железа от 10 до 100 мкмоль/л, при более высоких концентрациях железа он не найден. В целом молекулярные механизмы регуляции ответных реакций растений на условия Ре-дефицита изучены недостаточно.
Две первые описанные реакции растений стратегии I сопровождаются в ряде случаев появлением низкомолекулярных корневых экссудатов. В их составе идентифицированы соединения фенольной природы, рибофлавин, органические кислоты. Корневые экссудаты могут напрямую увеличивать доступность растениям железа путем подкисления ризосферы, образования растворимых комплексов или восстановления Pe(III). Основным донором электронов для восстановления окисленных форм железа являются фенолы: кофейная и хлорогеновая кислоты. Например, кофейная кислота может восстанавливать Fe(III) до Fe(II). Реакция состоит из двух основных этапов (рис. 6.1).
Первый этап очень короткий. Он состоит в переносе пяти электронов от молекулы кофейной кислоты до Fe(III) и образовании промежуточного продукта (I) неидентифицированной природы. На втором этапе относительно длинном он распадается с образованием двух компонентов А и В неустановленной природы.
С участием компонентов А и В осуществляется перенос еще четырех электронов на Fe(III). Рассмотренная реакция восстановления кофейной кислотой Fe(III) до Fe(II) может происходить в свободном пространстве и ризосфере корня. Вместе с тем оптимум этой реакции находится в кислой среде (pH 3-4). что ограничивает ее адаптивное значение в почвах с высокими значениями pH и буферной способностью. В целом редуктанты фенольной природы, по-видимому, не играют большой роли в восстановлении Fe3+, так как их вклад не превышает 6% от общей Fe3+-редуктазной активности корней.
Более важную роль в мобилизации трудно растворимых почвенных соединений железа играют органические кислоты: лимонная, яблочная и др. В ответ на Fе-дефицит концентрация в корнях растений стратегии I (горох, сахарная свекла, бобы, яблоня, огурец) яблочной и особенно лимонной кислоты может возрастать в 2-26 раз. Увеличение содержания органических кислот связывают с усилением фиксации корнями CO2, когда углерод включается в состав органических кислот, особенно лимонной, аминокислот и углеводов. Индуцированная Ре-дефицитом СО2-фиксация — следствие увеличения (в 2-14 раз) активности ФЕПК. После восстановления нормального снабжения железом корней активность ФЕПК пониженная: на 50%. Активность в корнях других ферментов, связанных с фиксацией углерода, например карбоангидразы, под воздействием Fe-дефицита не менялась.
В ризосферу органические кислоты выделяются путем диффузии, т. е. по электрохимическому градиенту, по ионным каналам или с помощью переносчика. В почвах с высокими значениями pH комплексы железа с яблочной и лимонной кислотами нестабильны. В кислом диапазоне pH, напротив, органические кислоты образуют достаточно прочные комплексы с железом, что благоприятствует поглощению железа растением.
Из расчетов с помощью компьютерных моделей следует, что в ризосфере концентрация цитратных комплексов Fe(III) составляет от 0,1 до 50 мкмоль/л. Имеются данные, что органические кислоты находятся в ризосфере в значительно более высоких концентрациях — до 90 ммоль/л.
Роль выделяемого корнями растений рибофлавина (рибофлавин-3'(5')-сульфата) в мобилизации железа пока не изучена. Это соединение — слабый восстановитель окисленных форм железа. Возможно, рибофлавин, обладающий, как известно, антимикробным действием, способен ограничивать рост микроорганизмов, конкурирующих с растениями за доступные формы железа.
Рассмотренные ответные реакции растений стратегии I на Fe-стресс тесно связаны с морфологическими и анатомическими изменениями в структуре клеток корня — утолщением кончиков корней, образованием корневых волосков и ризодермальных передаточных клеток в апикальной зоне. Индуцированное Fe-стрессом утолщение кончиков корней связано с увеличением объема клеток коры и их числа в антиклинальном направлении. Такое временное прекращение удлинения клеток не имеет ничего общего с симптомами недостатка бора или избытка алюминия, сопровождающихся деформацией клеток. Образование корневых волосков усиливается в ответ не только на условия Fe-дефицита, но и на действие других факторов среды: дефицита фосфора и кислорода, повышенных температур, плотности почвы и др. Дифференциация клеток корневых волосков при недостатке железа происходит, как и в обычных условиях, с участием этилена и ауксина.
У растений некоторых видов (сем. Proteaceae) в условиях Fe-дефицита появляются кластеры корней, которые состоят из множества боковых корней, обогащенных корневыми волосками. Ничего подобного не происходит в условиях недостатка бора.
Передаточные клетки характеризуются интенсивным развитием протуберанцев клеточной стенки, плотной цитоплазмой с множеством митохондрий, шероховатым эндоплазматическим ретикулумом, амебоидными пластидами. У растений некоторых видов
(р. Plantago) выросты клеточных стенок передаточных клеток простые по форме, у других
(p. Capsicum, Helianthus) — более сложные, лабиринтообразные, похожие на протуберанцы. В нормальных условиях передаточные клетки найдены в вегетативных и генеративных частях растений, где осуществляется интенсивный транспорт питательных веществ. В корнях передаточные клетки найдены в смежном с клубеньхами перицикле бобовых растений, сосудистой паренхиме, в местах образования боковых корней.
Образование в апикальной зоне корня передаточных клеток в ответ на Fe-дефицит связано с дифференциацией клеток в центральном цилиндре. У многих растений стратегии I передаточные клетки формируются в зоне корневых волосков со зрелыми элементами ксилемы; возможно, передаточные клетки задействованы в дальнем транспорте железа. В зоне растяжения передаточные клетки могут распространяться до гиподермы, если гибнут внешние эпидермальные клетки. Передаточные клетки встречаются также а зоне коры корня. В пределах одной и той же корневой системы формирование эпидермальных передаточных клеток отмечено только в частях корня, испытывавших дефицит железа. Следовательно, образование передаточных клеток в корне в большей степени зависит от локальных условий среды, а не от общего минерального статуса растений. Образование корневых волосков у мутанта
Arabidopsis manl/frd3, накапливавшего железо в побеге вследствие конститутивной экспрессии генов, вовлеченных в ответные реакции на Fe-дефицит, зависело, тем не менее, от обеспеченности среды железом. Все эти данные свидетельствуют о реальном существовании локальных механизмов адаптации растений к изменяющимся условиям внешней среды.
Образование передаточных клеток — адаптивный механизм, направленный на усиление транспорта железа из апопласте в симпласт. Во многих случаях эти клетки отвечают за увеличение в условиях Fе-дефицита выделения корнями H+ и повышение Fe-редуктазной активности. По-видимому, скопление митохондрий в передаточных клетках необходимо для обеспечения энергией индуцируемых Fe-дефицитом процессов.
Следует отметить, однако, что индуцированное образование передаточных клеток, сопровождающееся увеличением выделения протонов, не всегда влечет за собой увеличение редуктазной активности. Например, не выявлено различий в редуктазной активности между диким видом Arabidopsis и его мутантом RM57, не обладавшим способностью к формированию передаточных клеток. К выводу о том. что индуцируемое Fe-дефицитом восстановление Fe(III) до Fe(II) и образование передаточных клеток — два независимых процесса, приходят и другие авторы. Так, в опытах с мутантами-сверхнакопителями железа гороха
(dri и brz) и
Arabidopsis (man I) увеличение активности Fe-редуктазы в корнях индуцировал не только недостаток, но и избыток железа. Однако образование передаточных клеток зафиксировано только при недостатке железа. Обработка корней предшественником этилена 1-аминоциклопропанкарбоновой кислотой и аналогом ауксина 2,4-D вызывала, как и в условиях Fе-дефицита, образование передаточных клеток, но не были отмечены изменения Fe-редуктазной активности. Очевидно, образование передаточных клеток не является необходимым для индуцированного Fe-стрессом транспорта электронов.
В целом образование передаточных клеток рассматривается как типичный морфологический признак растений стратегии I.
Вызываемые недостатком железа реакции корней — увеличение Fe-редуктазной активности, утолщение кончиков корней, выделение рибофлавина — проявлялись быстрее при одновременном дефиците железа и меди. Этот обнаруженный в опытах с огурцом, горохом, соей и арабидопсисом эффект — результат синергического действия железа и меди. Дефицит меди вызывал у растений аналогичные индуцируемым дефицитом железа реакции, которые проявлялись с запаздыванием и с меньшей интенсивностью.
Эффект синергизма между железом и медью вряд ли возможен вследствие обострения в присутствии меди недостатка железа, так как медь не может транспортироваться селективной транспортной системой HATS, участвующей в поглощении железа. Возможно, проявление синергизма связано с регуляцией экспрессии кодирующих синтез Fe-редуктазы генов FRE1, индуцируемой недостатком железа или меди. При недостатке железа транскрипция этих генов активируется транскрипционным фактором ATF1, при недостатке меди — MACl. При одновременном дефиците железа и меди оба активатора транскрипции могут, по-видимому, связываться промотером Fe-редуктазы, вызывая эффект синергизма. Скорость других реакций может регулироваться промотером неизвестной природы. Предполагают также, что эффект синергизма, возможно, связан с участием меди в трансдукции сигнала для синтеза этилена. В присутствии кобальта — ингибитора синтеза этилена, ответные реакции растений па условия Fe,Cu-дефицита не проявлялись, тогда как в присутствии 1-амииоциклопропан-1-карбоновой кислоты — предшественника этилена, напротив, усиливались.
Стратегия II. Группа стратегии II представлена только растениями семейства злаков. Недостаток железа не только индуцирует синтез фитосидерофоров (мугеневой кислоты и ее производных), но и повышает скорость работы транспортирующей их комплексы с Fe(III) системы за счет дополнительного синтеза транспортного белка YS1 (Yellow Stripe 1). Усиление образования фитосидерофоров происходит вследствие увеличения экспрессии генов, кодирующих синтез никотианаминсинтазы и никотианаминтрансферазы.
Недостаток железа может индуцировать синтез сидерофоров не только у высших растений, но и у микроорганизмов, особенно у грибов. Сидерофоры способны формировать доступные для растений Fе(III)-хелаты, устойчивость которых сопоставима с этим показателем для фитосидерофоров. Снижению конкуренции между фитосидерофорами и сидерофорами за железо способствует пространственное разделение зон корня, активно участвующих в выделении и поглощении фитосидерофоров. и зон с высокой колонизацией бактерий.
В целом у растений стратегии I и II Fe-дефицит может индуцировать экспрессию множества генов (у ячменя около 200), однако далеко не все они вовлечены в ферментативные процессы, связанные со спецификой механизмов этих стратегий.
Регуляция ответных реакций. Возможна на локальном уровне (в корне) и с участием побега. Раньше упоминалось, что образование передаточных клеток в корне больше зависит от условий среды, чем от общего минерального статуса растений. Вместе с тем допускают возможность участия в регуляции ответных реакций корней на условия Fe-дефицита побега. Например, мутанты гороха brz и dgi формировали в побеге сигнал неизвестной природы, участвовавший в регуляции активности Fe-хелатредуктазы и H+-АТФазы в корнях. Природа поступающего из побега в корни сигнала пока не установлена. Предположительно в такой коммуникации могут быть задействованы фитогормоны, Fе-связывающие соединения, например белки IRT1 или экспортируемое из побега железо.
В передаче сигнала задействованы по меньшей мере два локализованных в побеге и корне сенсора. Вероятный кандидат на роль сенсора в корне — продукт, кодируемый генами FRD3. Мутант frd3 характеризовался проявлением ответных реакций всех трех типов на условия Fе-дефицита, что приводило к избыточному накоплению железа в корнях и листьях
Arabidopsis. Экспрессия генов FRO3 в корнях происходила как при избытке, так и при недостатке железа. Роль кодируемых FRD3 продуктов предположительно сводится к восприятию сигнала о Fe-статусе побега или участию в транспорте такого сигнала к внутриклеточному рецептору неизвестной природы. Природа сенсора, локализованного в побеге, пока не установлена. В трансляции сигнала о возникновении Fe-дефицита может участвовать повсеместно встречающийся у растений газообразный оксид азота (NO). Обработка этим газом изменяла фенотип Fе-неэффективных мутантов обеих стратегий адаптации к Fe-дефициту.
Влияние кремния. Направленность действия кремния на развитие хлороза у двудольных растений (тыквы, огурца) двойственная, целиком зависящая от функционирования семядолей. На ранних стадиях развития, когда у растений присутствовали зеленые (функционирующие) семядоли, кремний, несмотря на отсутствие железа в питательном растворе, препятствовал уменьшению концентрации хлорофилла в листьях, иными словами, замедлял проявление Fe-хлороза (рис. 6.2; 6.3, а). Обратный эффект кремния (обострение Fe-хлороза) наблюдали в двух случаях — у молодых растений после искусственного отделения зеленых семядолей (рис. 6.3, а) и у взрослых растений с семядолями, потерявшими свои функции вследствие естественного старения: пожелтевшими, усохшими (рис. 6.2).
Согласно результатам анализа у молодых двудольных растений (огурец Журавленок F1) с интактными зелеными семядолями при добавлении кремния железо концентрировалось в соке надсемядольной части побега (эпикотиль и черешки листьев). Параллельно исчезал типичный признак, сопутствующий Fe-недостатку - повышенна и концентрация марганца, возникающая вследствие Fе/Мn-антагонизма. Вызываемое кремнием увеличение концентрации железа в соке стебля отмечено и у гибрида огурца Семкросс F1 (рис. 6.3, б). Влияние кремния на концентрацию железа в гипокотиле (части побега, расположенной ниже семядолей) не обнаружено (табл. 6.1).
Искусственное удаление семядолей у молодых растений индуцировало противоположный эффект кремния: сильное (на 63%) уменьшение по сравнению с контролем концентрации эндогенных форм железа в надсемядольной части побега (рис. 6.3, б). Сходным было действие кремния на концентрацию железа в соке стеблей злаков.
Очевидно, влияние кремния на концентрацию хлорофилла в листьях (проявление Ре-хлороза) связано с его воздействием на транспорт в растениях эндогенных форм железа. Когда у двудольных семядоли функционировали, привнесение в среду кремния способствовало поддержанию в соке проводящей части побега, особенно расположенной над семядолями, повышенной концентрации железа (рис. 6.3, б) и увеличению тем самым сопротивляемости растений к заболеванию хлорозом (рис. 6.2; 6.3, а). Такая физиологическая реакция на кремний на фоне отсутствия железа в среде возможна вследствие возникновения в растениях условий, благоприятных для ремобилизации железа из семядолей или корней. He случайно убыль железа из семядолей огурца (Семкросс F1) на фоне Fе-дефицита мы регистрировали только в присутствии кремния (табл. 6.2). Кстати, аналогичный спровоцированный Fe-дефицитом отток эндогенного радиоактивного железа из семядолей по направлению к верхним листьям и цветочным примордиям замечен и в опытах с почвенной культурой сои.
Механизм столь удивительного синергического взаимодействия кремния с семядолями. вызывающего у двудольных растений улучшение акропетального транспорта эндогенных форм железа, пока не ясен. Скорее всего, кремний вовлечен в локализованный в семядолях синтез транспортных лигандов, например никотианамина, способных препятствовать клеточной сорбции железа и облегчать ремобилизацию этого микроэлемента в вегетативных частях растений. В растениях никотианамин играет важную роль в дальнем транспорте микроэлементов. Обработка никотианамином мутанта томата с нарушенным синтезом этого соединения приводила к усилению в условиях Fe-дефицита оттока 4Fe из семядолей и гипокотиля. Однако в настоящее время у нас нет информации, отражающей роль кремния в синтезе задействованных в транспорте железа лигандов. Необходимы дальнейшие исследования.
В регуляции эндогенного транспорта железа могут быть задействованы и гормоны, играющие, как известно, лажную роль в адаптации растений к Fe-дефициту. Обработка корней фасоли гибберелловой кислотой стимулировала перемещение поглощенного корнями железа к другим частям растений. Гиббереллины могут вырабатываться в семядолях (огурца, томатов) — органах, контролирующих уровень этого фитогормона и его предшественников в гипокотилях. Однако механизм влияния кремния на синтез гиббереллинов (или других гормонов) в семядолях также не изучен. Хотя известно о положительном влиянии кремния на эндогенный уровень гиббереллинов в побегах риса.
Таким образом, мы впервые показали, что кремний способен выполнять уникальную роль — увеличивать устойчивость двудольных растений к условиям дефицита железа. В присутствии кремния у молодых растений (огурец, тыква) замедлялось развитие симптомов Fe-хлороза вследствие возрастания концентрации железа а соке проводящей части побега, особенно над семядолями (эликотиль и черешки листьев). Этот эффект исчезал с прекращением функционирования семядолей в результате их естественного старения или после их искусственного удаления, и не проявлялся у злаков (ячменя, кукурузы). В условиях нормального снабжения растений микроэлементами (Fe, Mn, Zn) влияние кремния на концентрацию хлорофилла в листьях и рост побегов было несущественным.
