Метод Андерсона
Метод основан на извлечении органических фосфатов 3 н. NaOH при нагревании, после предварительного декальцирования почв 0,1 н. HCl. Из щелочного экстракта удаляют гуминовые кислоты и полуторные окислы, а затем для очистки фитатов и разрушения комплексов с полисахаридами и протеинами их осаждают ацетатом бария в присутствии алкоголя. Осадок фитатов Ba промывают и растворяют катионообменной смолой в Н-форме. Полученный фильтрат фитиновых кислот пропускают через анионообменную смолу, насыщенную муравьиной кислотой. Из смолы инозитфосфаты элюируют нейтральным раствором муравьинокислого аммония (HCOONH4, pH 7,0) с повышающимся градиентом концентраций: 0,24; 0,41; 0,55; 0,62; 1,2 M (с объемами 100; 300; 300; 100 и 100 мл соответственно). При этом последовательно вытесняются: 1) ортофосфаты и моноинозитфосфаты, 2) диинозитфосфаты; 3) триинозитфосфаты; 4) тетраинозитфосфаты; 5) смесь пента- и гексаинозит-фосфатов. В целом, чем больше молей фосфата входит в молекулу инозита, тем большая концентрация NH4-формиата требуется для вытеснения (элюции) инозитфосфатов из смолы.
Так как фосфаты в 1—4 фракциях содержатся в незначительных количествах, то, пропуская через колонку растворы HCOONH4 с концентрацией 0,6 M и 1,2 М, можно разделить инозитфосфаты на две большие фракции: ортофосфаты и низкомолекулярные эфиры инозитфосфатов (моно-, ди-, три-, тетраинозитфосфаты) и сложные эфиры инозитфосфатов (пента- и гексаинозитфосфаты, которые практически неразделимы).
Ход анализа. 5 г воздушно-сухой почвы (сито d 0,25 мм) помещают в стеклянные (жаростойкого стекла) центрифужные пробирки емкостью 200 мл, приливают 100 мл 0,1 н. HCl и взбалтывают в течение часа при 20° С. Суспензию центрифугируют, раствор выбрасывают, а остаток почвы в центрифужной пробирке обрабатывают еще раз 100 мл 0,1 н. HCl. Если при этом карбонаты не полностью разрушены (продолжается выделение пузырьков CO2), то обработку 0,1 н. HCl повторяют третий раз. Все солянокислые растворы выбрасывают. После этого остаток почвы промывают от кислоты 100 мл дистиллированной воды, взбалтывают от руки, центрифугируют. Раствор выбрасывают, остаток почвы заливают 40 мл 3 н. NaOH и нагревают на кипящей водяной бане в течение 12-ти час. с периодическим перемешиванием суспензии. Чтобы избежать выпаривания растворов при нагревании, центрифужные пробирки закрывают сверху перевернутыми маленькими коническими колбочками. После нагревания растворы охлаждают, центрифугируют, прозрачный раствор сливают в другие центрифужные пробирки. Остаток почвы промывают дважды водой, порциями по 20 мл, центрифугируют. Промывные воды добавляют к щелочному экстракту, получают раствор А. Остаток почвы выбрасывают.
Раствор А подкисляют 90 %-ной HCOOH до pH 4, при этом выпадают гуминовые кислоты, затем подщелачивают до pH 8—9 крепким NH4OH, осаждаются полуторные окислы. Спустя 15 мин. суспензию центрифугируют. Раствор сливают в другие центрифужные пробирки, получают раствор Б. Осадок промывают 20 мл воды, центрифугируют, промывные воды добавляют к раствору Б, осадок выбрасывают. К раствору Б приливают равный объем этанола и 10 мл 30%-ного раствора (CH3COO)2Ba, выпадает осадок фитатов бария, его коагулируют 10 мин. на кипящей водяной бане и настаивают в течение ночи в закрытых пробирках, затем смесь центрифугируют, центрифугат выбрасывают, а осадок дважды промывают 10—20 мл 50 %-ного этанола, центрифугируют и центрифугаты выбрасывают. Осадок фитатов высушивают и рерастворяют, взбалтывая с 50 мл воды и 25 мл катионообменной смолы (амберлит IR-120) в Н-форме. После растворения осадка смолу отделяют от раствора фильтрованием. Фильтрат затем используют для хроматографического анализа.
Раствор, содержащий инозитфосфаты, пропускают со скоростью 0,5 мл/мин через анионообменную колонку (160х12 мм), наполненную смолой Дауэкс-1 (сито d 0,25—0,5 мм) в формиатной форме. Осажденные фосфаты затем элюируют, также со скоростью 0,5 мл/мин, сперва с помощью 300 мл 0,6 M HCOONH4, pH 7,0 (элюат I), а затем в другую колбу собирают элюаты с 85 мл 1,2 M HCOONH4. Спустя один час пропускают еще 5 мл 1,2 M HCOONH4, затем через 30 мин. еще 5 мл и через 30 мин. последние 5 мл 1,2 M HCOONH4. Таким образом, элюируют в 100 мл все инозит пента- и гексафосфаты (элюат II). В 300 мл элюата I переходят ортофосфаты и все низкомолекулярные фосфорные эфиры инозита.
Аликвоты элюатов I и II выпаривают на водяной бане и окисляют с добавлением раствора Mg(NO3)2 при сжигании в муфеле, точно так же, как в случае определения фосфолипидов. В окисленных растворах определяют фосфор колориметрически.
Мы рекомендуем окисление фракций органических фосфатов в элюатах I м II проводить после их предварительного выпаривания, с помощью 5—10 мл 50% HClO4 (см. выше определение органических фосфатов по Хейфец). На рис. 8 приведены результаты хроматографического разделения на колонке анионита (формиатная форма) различных изомерных форм инозит пента- и гексафосфатов. Как следует из рис. 8, наибольшее количество в смеси сложных фосфорных эфиров падает на долю мио- и dl-инозитгексафосфатов.
Для более подробного изучения состава полифосфатной смеси инозитов проводят их хроматографическое разделение на бумаге без предварительного гидролиза и после их гидролиза до инозитов.
Реактивы. 1. 0,1 н. HCl и 6 н. HCl.
2. 3 н. NaOH.
3. 0,6 и 1,2 M HCOONH4. Соответственно 37,8 и 75,6 г соли формиата аммония растворяют в 800 мл воды, доливают водой до 1 л, перемешивают.
4. 90%-ная НСООН.
5. 30%-ный (CH3COO)2Ba (ацетат бария).
6. Этанол 96° и 50%-ный водный раствор.
7. Катионит Н-форма и анионит — COOH (формиатная) форма.
