Определение форм фосфорных соединений в растениях (часть 4)
Определение фосфора нуклеиновых кислот. Осадок в пробирках после извлечения фосфора липидов заливают 20 см3 1 н. раствора хлорной кислоты, закрывают пробкой и после диспергирования осадка помещают пробирки в холодильник с температурой 3°С на 17 ч. По истечении этого времени пробирки энергично встряхивают, пробки удаляют и содержимое пробирок (после уравновешивания) центрифугируют в течение 10 мин при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в колбу Кьельдаля.
В пробирки заливают новые порции 1 н. раствора хлорной кислоты (20 см3) и после диспергирования осадка стеклянной палочкой или энергичным встряхиванием закрытых пробками пробирок; центрифужные, а затем пробирки без пробок ставят на водяную баню при 70°С на 30 мин. После этого пробирки уравновешивают и центрифугируют. Центрифугат сливают в ту же колбу Кьельдаля, а осадок в пробирках снова обрабатывают 20 см3 0,5 н. хлорной кислоты и пробирки устанавливают в водяную баню на 30 мин при температуре 70°С.
После уравновешивания пробирок содержимое их центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают в ту же колбу Кьельдаля. В колбы Кьельдаля с собранным центрифугатом приливают 5 см3 концентрированной серной кислоты, затем их устанавливают в вытяжную нишу и сначала на слабом огне выпаривают содержимое колб, а потом озоляют при нормальном кипячении до полного обесцвечивания.
Полученный и охлажденный раствор количественно при многократном споласкивании колбы Кьельдаля дистиллированной водой переносят в мерную колбу на 100 см3.
Объем в мерной колбе после охлаждения доводят дистиллированной водой до метки и после перемешивания из нее берут 5 или 10 см3 раствора, переносят в другую мерную колбу объемом 100 см3, приливают 30-40 см3 дистиллированной воды, три капли индикатора бета-динитрофенола (или фенолфталеина) и нейтрализуют раствор щелочью до появления слабо-желтого окрашивания. Затем в колбу добавляют все необходимые реактивы для определения фосфора и через 5-7 мин измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре, как указано выше.
Определение белкового фосфора. Осадок в центрифужной пробирке после извлечения фосфора нуклеиновых кислот количественно, смывая дистиллированной водой (небольшим объемом), переносят в колбу Кьельдаля, добавляют 5 см3 смеси серной и хлорной кислот и озоляют в нише для сжигания. После того как раствор в колбе станет полностью прозрачным, его охлаждают и, многократно ополаскивая колбу Кьельдаля дистиллированной водой, переносят в мерную колбу объемом 100 см3. После охлаждения раствора в мерной колбе объем в ней доводят дистиллированной водой до метки и после перемешивания берут 5 или 10 см3 этого раствора в другую мерную колбу на 100 см3 и проводят все вышеизложенные операции по определению фосфора.
Содержание фосфора в каждой фракции определяют по формуле
где Х - содержание P2O5, %; а - количество Р2O5, найденное по градуировочному графику, мг; V - объем экстракта, см3; H - навеска растительного материала, г; V1 - объем вытяжки, взятый для окрашивания, см3.
Реактивы: 1) хлорная кислота HClO4 10%-ная;
2) хлорная кислота, HClO4, 1 н.;
3) хлорная кислота 0,5 н.;
4) смесь хлорной и серной кислоты - к 10 частям концентрированной серной кислоты (пл. 1,84 г/см3) добавляют 1 часть 57%-ной хлорной кислоты;
5) 10%-ный раствор NaOH; 10 г NaOH растворяют в колбе объемом 100 см3 дистиллированной водой;
6) индикатор бета-динитрофенол или фенолфталеин;
7) этиловый спирт 96%-ный и 80%-ный эфир - к 3 частям спирта добавляют 1 часть эфира и перемешивают.
