Метод Хенса и Андерсона
Метод основан на двукратной обработке навески почвы смесью минеральных кислот (HCl HF) в течение ночи с последующим отмыванием избытка кислот дистиллированной водой. Полученные центрифугаты выбрасывают. Проводят затем последовательную экстракцию остатка почвы ацетоном, петролейным эфиром, смесью этанола и бензола, смесью метанола и хлороформа. Полученный раствор перемешивают, выпаривают и из сухого остатка реэкстрагируют фракцию фосфолипидов рядом последовательных обработок смесью этилового эфира и петролейного эфира, хлороформа и др. После выпаривания реэкстракта липоидный остаток окисляют и в растворе определяют фосфор колориметрически. Полученные Хенсом и Андерсоном значения фракции фосфолипидов колебались от 0,31 до 0,70 мг P на 100 г почвы, что составляло 0,6—0,9% от общего содержания органических фосфатов.
Ход анализа. 1 г воздушно-сухой почвы (сито d 0,25 мм) помещают в центрифужные пробирки на 100 мл и взбалтывают в течение 6 час. с 10 мл смеси равных объемов 2,5%-ной HCl и 2,5%-ной HF. Суспензию центрифугируют, центрифугат выбрасывают. К остатку почвы в центрифужной пробирке приливают еще 10 мл смеси кислот и обработку повторяют. После этого почву промывают порциями по 10 мл воды до отсутствия кислот (проба с индикаторной бумагой). Промывные воды выбрасывают.
К промытому остатку почвы приливают 50 мл ацетона, закрывают пробирки полиэтиленовыми или стеклянными крышками и оставляют на 4 часа, перемешивая тщательно содержимое через каждые 20—30 мин., затем смесь центрифугируют и прозрачный раствор сливают в 500-миллилитровую бутыль, закрывающуюся стеклянными пробками (желательно притертыми).
Точно так же остаток почвы последовательно обрабатывают 50 мл петролейного эфира, затем 50 мл смеси этанола и бензола (1 : 5 по объему) и 50 мл метанола и хлороформа (1 : 1 по объему). Все три центрифугата добавляют к ацетоновому экстракту. Получают раствор А. Раствор А выпаривают затем досуха при низкой температуре и давлении. В полученном остатке реэкстрагируют фракцию фосфолипидов, последовательно обрабатывая его следующими растворами: а) 20 мл холодной смеси эфира и петролейного эфира (1 : 1 по объему) в течение 2 мин., декантируют; б) 20 мл холодного хлороформа в течение 2 мин., декантируют; в) 20 мл холодной смеси этилового и петролейного эфиров (1 : 1 по объему), доводят до кипения на водяной бане, декантируют; г) 20 мл холодного хлороформа, нагревают до кипения на водяной бане, декантируют.
Реэкстракты а, б, в, г сливают в одну и ту же фарфоровую чашку (или большой тигель) и выпаривают на водяной бане досуха. В полученном остатке определяют общее содержание липоидного фосфора в почве.
Определение фосфора. Липоидный остаток в фарфоровой чашке (или тигле) смачивают 1 мл этанола и 1 ли 12%-ного водного раствора Mg(NO3)2, смесь выпаривают на водяной бане досуха, прокаливают при 600° С в течение 12 мин., затем растворяют в 15 мл 1 н. HCl, выпаривают досуха на водяной бане. К сухому остатку добавляют 1 мл 1 н. HCl и смесь количественно переносят горячей водой в мерные колбы на 50 мл, охлаждают, нейтрализуют раствор и определяют в нем фосфор колориметрически.
Мы рекомендуем выпаренные остатки фракции фосфолипидов окислять 3—7 мл 50%-ной HClO4 (см. определение органического фосфора по методу Хейфец).
Хроматография на бумаге. Хенс и Андерсон предложили идентификацию продуктов щелочного и кислотного гидролиза фракции фосфолипидов (глицерофосфата, холина, этаноламина, серина, инозитола и др.) проводить с помощью бумажной хроматографии с последующей элюцией с бумаги отдельных компонентов гидролизата и их количественного определения.
Реактивы. 1. 2,5%-ная HCl. 58 мл концентрированной HCl (уд. вес 1,19) доливают до 1 л водой.
2. 2,5%-ная HF. ~ 80 мл 35,5 %-ной HF (уд. вес 1,15) доливают до 1 л водой. Раствор сохраняют в полиэтиленовой посуде.
3. Смесь 2,5%-ной HCl и 2,5%-ной HF. Смешивают равные объемы двух кислот.
4. 1 н. HCl. 82 мл HCl (уд. вес 1,19) доливают водой до 1 л, перемешивают.
5. 12%-ный раствор Mg(NO8)2.
6. Ацетон (диметилкетон) — CH3COCH3.
7. Этанол (этиловый спирт) — C2H5OH.
8. Метанол (метиловый спирт, карбинол, древесный спирт) — CH3OH.
9. Этиловый эфир (диэтиловый) — (C2H5)2O.
10. Бензол — C6H6.
11. Хлороформ — CHCl3.
12. Петролейный эфир (t кипения 40—60° С) — светлые легкие фракции керосина.
